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废水和空气样本中SARS-CoV-2 RNA的定量和全基因组表征

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65053
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 3, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4,5, 1,2
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

该协议旨在量化废水和空气样本中的SARS-CoV-2 RNA，用于基于废水的流行病学研究，并评估室内和室外气溶胶中SARS-CoV-2的暴露风险。该协议还描述了用于 SARS-CoV-2 全基因组表征的平铺扩增子长模板测序方法。

Abstract

在许多国家，基于废水的流行病学已成为一种有前途且有效的SARS-CoV-2和其他传染病监测系统。该过程通常涉及废水浓缩、核酸提取、选定基因组片段的扩增以及扩增基因组片段的检测和定量。这种方法同样可用于检测和量化空气样本中的传染性病原体，例如SARS-CoV-2。最初，据推测，SARS-CoV-2 主要通过与感染者在说话、打喷嚏、咳嗽、唱歌或呼吸时产生的飞沫密切接触传播。然而，越来越多的研究报告说，医疗机构的空气中存在SARS-CoV-2 RNA，将空气传播确定为病毒的可行途径。本研究提出了一系列既定的协议，以促进废水和空气样本中病毒的环境检测、定量和测序。

Introduction

2019 年 12 月，出现了一种名为 COVID-19 的新型疾病，由以前未知的冠状病毒 SARS-CoV-2引起 1.由此产生的全球大流行给全球临床和公共卫生实验室带来了重大挑战，因为大量个人需要检测以准确评估病毒在社区中的传播和流行情况。然而，在许多地区，及时和空间全面地达到必要的测试水平在经济上是不可行的 2,3.目前基于个体临床诊断的监测系统在很大程度上依赖于症状严重程度和个体报告，以及这些症状与人群中流行的现有疾病重叠的程度4,5,6,7,8,9,10。因此，大量无症状病例导致疾病负担被严重低估7,11。

由于这些挑战，COVID-19监测的基于废水的流行病学（WBE）被提议作为补充监测策略。WBE于2001年首次被描述12，最初用于追踪可卡因和其他非法药物13。这种方法依赖于这样的假设，即可以计算出废水中稳定并由人类排泄的任何物质的初始浓度8,12。WBE已在许多国家成功实施，作为SARS-CoV-2 3,8,14,15,16的补充和有效监测系统。在水生环境中检测人类病毒的大多数方法都遵循以下步骤：浓度、核酸提取、所选基因组片段（或多个片段）的扩增以及扩增基因组片段的检测/定量3.

检测和定量SARS-CoV-2的另一个重要环境是在空气样本中。最初，SARS-CoV-2 被认为主要通过密切接触感染者在说话、打喷嚏、咳嗽、唱歌或呼吸时产生的气溶胶产生的呼吸道飞沫传播17.然而，一些研究开始报告空气中存在 SARS-CoV-2 RNA，尤其是在医疗机构和其他封闭空间中 18,19,20,21。当病毒浓度足够高时，在医院和其他封闭空间的室内采集的空气样本中发现了 SARS-CoV-2 活力的证据22,23,2 4。户外研究通常没有发现SARS-CoV-2的证据，除了在拥挤的户外空间21,25,26,27,28,29。截至目前，SARS-CoV-2的空气传播已被公认为一种传播方式30,31。最近的一项回顾性研究表明，室外和室内之间存在差异，在室外，在拥挤区域之外，空气传播的风险最小，而室内则在通风不良的环境中可能存在更大的风险，其中可能存在强源（即感染人数）。最近的一项综合评价研究强调了室外环境与室内环境中空气传播风险之间的巨大差异，特别是在通风不良的拥挤地区。该研究表明，在室外环境中，空气传播的风险很小，因为室外环境中有较大的空气可用于稀释和分散病毒颗粒32。这些发现对与COVID-19相关的公共卫生政策和指南具有重要意义。通过认识到室内和室外环境之间传播风险的显著差异，政策制定者可以制定更有效的策略来减轻病毒的传播并保护公众健康。

有多种方法和方案可用于检测、定量和测序来自不同环境样本的 SARS-CoV-2。本文旨在介绍一套成熟的协议，允许具有不同能力水平的实验室对废水和空气样品中的病毒进行环境检测、定量和测序。

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Protocol

这里描述的所有方法都已在其他地方发表，并包含对原始方法的小修改。

1、废水收集及样品预处理

注：由于环境样品中SARS-CoV-2 RNA的浓度较低，因此实施浓度步骤对于成功检测至关重要33,34,35。这里描述的是第一种报道的在废水中检测SARS-CoV-2的方法36。

  1. 废水样本的收集和浓缩
    1. 收集 1 L 24 小时复合废水样品。将样品储存在4°C，并在24小时内继续执行方案。
    2. 通过轻轻摇晃瓶子使样品均质化。将 70 mL 收集到 100 mL 离心管中，或将样品分成两个 50 mL 的离心管中。
    3. 将 20 μL 月经病毒 （3.2 x 103 拷贝/μL） 加标到每个样品的 70 mL 中，作为浓缩过程的内部对照。或者，将 10 μL mengovirus（3.2 x 103 拷贝/μL）加标到每个 50 mL 离心管中。
    4. 匀浆样品并以700×g离心10分钟以除去大颗粒和生物（颗粒）。
    5. 通过在4°C下以4,000× g 离心40分钟，使用截止为10KDa的离心超滤装置将所得上清液用于浓缩。 通过以700× g 离心40分钟并反转超滤装置的位置来洗脱浓缩液。
    6. 测量所得浓缩物的体积。体积将根据样品中堵塞离心过滤器的固体量而变化。在这项研究中，获得的浓缩体积在 200-1,200 μL 之间。
    7. 使用商业试剂盒或内部方法将所得浓缩物用于RNA提取。对于本研究中使用的样品，使用洗脱体积为 50 μL 的用于病毒 RNA 提取的特定商业试剂盒。
    8. 使用荧光RNA定量试剂盒测量提取的RNA的浓度。将提取的RNA分成等分试样，并在-80°C下冷冻直至进一步分析。
      注：对于每个RNA分离程序集，应包括分离阴性对照（NCI），仅包含缓冲液以检测提取过程中可能的污染。
  2. 使用科里奥利紧凑型空气采样器收集空气样本
    1. 通过定义采样频率和采样位置，根据研究目标选择采样策略。
    2. 在空气采样器上设置流速（此处为 50 L/min，持续 30 分钟）。请注意，超过 200 L/min 的流速会降解病毒 RNA，因此建议使用低于 200 L/min 的流速。
    3. 在开始收集之前，通过脉冲启动将无菌锥体放入空气采样器中。取样完成后，将 5-15 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 加入锥体中。用手轻轻涡旋或摇晃样品15秒。将样品在4°C或-80°C的冷冻管中储存长达24小时。
    4. 可以执行可选的浓缩步骤。每次实验后使用漂白剂清洁和净化锥体。
    5. 使用商业试剂盒或内部方法提取RNA。对于本研究中的样品，使用洗脱体积为 50 μL 的用于病毒 RNA 提取的特定商业试剂盒。
    6. 使用荧光RNA定量试剂盒测量提取的RNA的浓度。将提取的RNA分成等分试样，并在-80°C下冷冻直至进一步分析。
      注：对于每个RNA分离程序集，应包括分离阴性对照（NCI），仅包含缓冲液以检测提取过程中可能的污染。

2. 通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）定量SARS-CoV-2 RNA

注意：以下方案符合CDC 2019-新型冠状病毒（2019-nCoV）RT-PCR诊断面板37。将引物/探针混合物分成若干等分试样，以避免冻融循环。

  1. 为每个靶标（门戈病毒;SARS-CoV-2 [N1 和 N2 基因]），如 表 1 所示，在试剂设置室的干净罩中。将引物/探针混合物和酶倒置混合五次。或者，轻脉冲涡旋引物/探针混合物和酶五次。
    注意：在制备和使用过程中保持所有试剂低温。为了尽量减少冻融循环，强烈建议以等分试样冷冻。
  2. 旋转（1,000 x g 15-30 秒）试管以收集底部的内容物，并将试管放在冷架或冰上。
  3. 为每个靶标标记 1.5 mL 微量离心管。向每个微量离心管中添加所需的每种试剂的量（每个反应的体积乘以反应次数，包括所需的对照）。通过上下移液混合并离心5秒以收集底部的内容物。
  4. 将微量离心管保持在冷架中，并将 15 μL 分配到冷却架中的条状 PCR 管或 96 孔板中。盖上板，移至核酸处理区（放在冷却架中）。
  5. 解冻提取的RNA的等分试样，轻轻涡旋5秒。将 5 μL RNA（除了 5 μL 非模板对照 [NTC]、分离阴性对照 [NCI] 和阳性对照 [PC] 之外）移液到含有先前制备的预混液的每个反应孔或试管中。根据需要经常更换手套，以避免交叉污染。
  6. 盖住整个反应板或试管，轻轻涡旋。离心（1,000×g，15-30秒）板或PCR管。
  7. 在以下循环条件下开始25μL RT-qPCR：逆转录酶在45°C下10分钟;聚合酶在95°C下活化10分钟;在95°C下变性45次，持续15秒;并在60°C下退火/延伸45s。
  8. 计算 Conte 等人报告的月经病毒对照的恢复效率38：
    Equation 1 × 100

3. 废水中的测序变异和数据分析

注：所描述的协议是由Quick等人创建的修改协议39,40。它使用两组引物通过PCR平铺方法扩增SARS-CoV-2基因组-ARTIC引物和VarSkip引物。引物组合用于保证最佳的基因组覆盖率，并最大限度地减少新突变导致一种类型引物失败的可能性。一般来说，该方案分为三个部分：逆转录（RT）和扩增子生成、测序文库制备以及测序和数据分析。

  1. 逆转录和扩增子生成
    1. 确保输入样品具有已知的qPCR循环阈值（Ct）值，以便在PCR级水中正确稀释它们。Ct值是在使用qPCR定量期间获得的。稀释度如下：如果Ct值为12-15，则按1：100稀释样品;如果Ct值为15-18，则按1：10稀释样品;如果Ct值为18-35，则不要稀释样品。Ct 值高于 35 的样品很有可能不起作用。
    2. 在PCR板中，将16μL每个样品移液至其在板上的位置。加入 4 μL 逆转录 （RT） 预混液 （5x）。盖上板，在以下条件下开始PCR反应：25°C2分钟，55°C20分钟，95°C1分钟。
    3. 制备每个引物组（ARTIC池A和池B，以及VarSkip池A和池B）的10μM稀释液。如 表2所示，为每组引物（ARTIC组A和B以及VarSkip组A和B）准备预混液。由此将产生四个预混液。
    4. 在新的PCR板上，将20μL预混液移液到每个相应的孔中。向每种混合物中加入 5 μL RT 样品。
      注：每个样品将有四种反应混合物 - ARTIC 池 A 和 B，以及 VarSkip 池 A 和 B。
    5. 盖上板并开始PCR反应如下：聚合酶在98°C下活化30秒;在98°C下变性35次，持续15秒;并在65°C下退火/延伸4分钟。旋转（1,000 x g 15-30 秒）板。合并 ARTIC 反应池并分别合并 VarSkip 反应池。每个样品将有两个 50 μL 扩增子反应。
    6. 向每个孔中加入 50 μL 用于 PCR 纯化的微球试剂，并通过移液充分混合。在室温下孵育5分钟。
      注意：每次使用前，将PCR纯化试剂剧烈混合以重悬磁珠。
    7. 将板放在磁分离架上，等待珠子形成沉淀，液体澄清（~5分钟）。移液管并弃去上清液。将PCR板放在磁性支架上。
    8. 将PCR板保持在磁性支架上，向每个样品中加入200μL 80%乙醇，而不接触珠子沉淀。除去乙醇。
    9. 重复上一步。将磁性支架上的板揭开 30 秒，让乙醇蒸发。
    10. 从磁性支架上取下板，向每个样品中加入 15 μL PCR 级水。通过移液重悬沉淀。在室温下孵育2分钟。
    11. 将板放回磁性支架上，让珠子沉淀（2分钟）。小心地将每个样品中的15μL上清液移液到新的PCR板中。
    12. 用荧光RNA定量试剂盒测量每个样品的浓度。取 12.5 μL 中每个样品约 50 ng 进行下一步。如果需要，在PCR级水中稀释样品。
  2. 文库制备
    1. 向每个样品中加入 1.75 μL 来自 Illumina DNA 文库制备试剂盒的反应缓冲液和 0.75 μL 酶混合物。盖上板，短暂涡旋，然后旋转（1,000× g ，持续15-30秒）。在 21°C 下孵育 5 分钟，在 65 °C 下孵育 5 分钟。
    2. 在新板中，将每个样品的 3 μL PCR 级水移液到新的 PCR 板中。加入 0.75 μL 制备的样品、1.25 μL 用于测序文库制备的条形码和 5 μL 的 T4 DNA 连接酶预混液。通过移液充分混合，在离心机中短暂旋转（1,000× g ，持续15-30秒），并在21°C下孵育20分钟，在65°C孵育10分钟。
      注意：如果使用少于 25 个样品，则在此步骤中将所有体积加倍。
    3. 通过将每个样品的 10 μL 加入同一个低结合管中，将所有样品汇集在一起。取 480 μL 进行下一步。
    4. 向池中加入 192 μL 用于 PCR 纯化的微球试剂，并通过移液充分混合。在室温下孵育10分钟。
    5. 将试管放在磁性支架上，等待上清液清除并形成珠子颗粒。除去上清液。从磁性支架上取下管子。
    6. 加入 700 μL 短片段缓冲液 （SFB） 并通过移液混合。放回磁性支架上，等待颗粒形成和液体清除（~5分钟）。移出上清液并丢弃。
    7. 重复上一步。将试管留在磁性支架上。加入 100 μL 80% 乙醇，不接触珠子。移出乙醇，让珠子干燥30秒。
      注意： 不要让珠子过度干燥。
    8. 从磁性支架上取下试管，加入 35 μL PCR 级水。通过移液混合并在室温下孵育2分钟。将试管放在磁性支架上，让珠子沉淀，液体清澈。将 35 μL 上清液移液到新管中。
    9. 测量合并文库的RNA浓度。移液器达到 30-50 ng RNA 的量所需的体积，并用 PCR 级水填充以达到 30 μL 的最终体积。
    10. 制备接头连接反应混合物：30 μL 混合文库、5 μL 接头混合物 II、10 μL 连接反应缓冲液 （5x） 和 5 μL T4 DNA 连接酶。通过移液和离心混合（1,000× g ，持续15-30秒）。在室温下孵育10分钟。
    11. 加入 20 μL 用于 PCR 纯化的微珠试剂，并通过移液混合。在室温下孵育10分钟。
    12. 将试管放在磁性支架上，等待珠子沉淀形成，上清液变为无色。小心地移出并弃去上清液。
    13. 从磁性支架中取出并加入 125 μL SFB。通过移液混合并放回磁性支架上以分离珠子。当液体澄清时，移液并弃去上清液。
    14. 重复上一步。将试管打开在磁性支架上 30 秒，让一些剩余的液体蒸发。
    15. 从磁性支架上取下试管，加入 15 μL 洗脱缓冲液。通过移液充分混合并短暂旋转（1,000 x g 15-30 秒）。在室温下孵育5分钟。放在磁性支架上 2 分钟。
    16. 将 15 μL 上清液移液到新的低结合管中。这是最后一个库。用荧光DNA定量试剂盒测量浓度。
      注：下一步需要 12 μL。如果浓度非常高且需要的文库少于 12 μL，则用洗脱缓冲液试剂填充至 12 μL。
  3. 流通池上样和测序
    1. 将流通池（R9.4.1）插入实时DNA和RNA测序装置中。
    2. 通过将 30 μL 冲洗系绳 （FLT） 试剂加入一管冲洗缓冲液 （FB） 试剂中来制备引物混合物。涡旋混合并旋转（1,000 x g 15-30 秒）。
    3. 打开灌注端口盖。使用 1,000 μL 移液器，设置为 200 μL，然后将吸头插入灌注口。转动音量设置轮并增加音量，直到看到吸头中的液体。丢弃尖端。
      注意： 只能转动轮子，直到看到尖端中有几 μL 的液体。拉取较大量可能会损坏流通池。
    4. 缓慢地将 800 μL 的引物混合物加入灌注端口，注意不要引入气泡。等待 5 分钟。
    5. 同时，准备要加载的库。混合 37.5 μL 测序缓冲液、25.5 μL 上样缓冲液和 12 μL 文库。
      注意：移液前混合上样缓冲液。该试剂中的磁珠沉降非常快。
    6. 打开端口盖。将 200 μL 灌注混合物移液到灌注端口中。
      注意：在盖子打开的情况下移液到灌注口时，会注意到从样品口流出小液滴。移液器速度足够慢，以便样品端口可以将液滴拉入而不会溢出。
    7. 在加载准备好的文库之前，通过移液充分混合。使用设置为 75 μL 的 100 μL 移液器，将文库和移液器逐滴移入样品端口。请勿触摸端口并等待每一滴被吸收到端口中后再加载下一滴，以免液体溢出。
    8. 关闭盖板端口和灌注端口。打开软件，开始测序实验。选择 basecalling On。对于具有 96 个多重样本的文库，10-12 小时的测序通常足以产生足够的数据。
      注意：使用该软件，可以插入.csv格式的样品表。样品表需要以下数据：flow_cell_id、position_id、sample_id、experiment_id、flow_cell_product_code和套件。需要流通池 ID（列在流通池侧面）以及使用的套件。对于建议的方案，应选择 LSK109 试剂盒。
  4. 测序数据分析
    1. 将压缩的 fastq 读取插入到 wf-artic 工作流41 中。使用两种不同的引物方案（ARTIC/V4.1 和 NEB-VarSkip/v1a）分别运行工作流程。二”。primertrimmed.rg.sorted.bam“文件是为每个样本创建的。
    2. 使用“samtools merge”命令将 BAM 文件合并为一个文件42.将合并的 BAM 文件插入 Freyja 工具，保留默认设置，以恢复相对谱系丰度43.
    3. 若要创建 FASTA 文件，请使用默认设置44,45 将合并的 BAM 文件插入到“samtools mpileup”和“ivar”工具中。对于突变调用，将 FASTA 文件加载到 Nextclade 工具46,47 中。

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Representative Results

表 3 中总结的结果显示了使用本文所述方法检测和定量废水和空气样品中 SARS-CoV-2 RNA 的示例。从西班牙和斯洛文尼亚的废水处理厂收集废水样品，如果三次重复中至少有两次的Ct低于40，则认为阳性，如果Ct的变异小于5%，则定量被认为是有效的。在西班牙和葡萄牙，收集了室内和室外空气样本，并应用了相同的规则。空气样本使用重复样本，而不是废水样本使用一式三份，因为该研究的目的是检测SARS-CoV-2 RNA，而不是对其进行量化。此外，只有当使用的所有对照（如本协议所述）都按预期运行并且未观察到门戈病毒RNA对照中出现显着偏差时，RT-qPCR运行才被认为是有效的。对于这些样品，门戈病毒回收效率在13.7%至19.7%之间变化。通过稀释 10 倍和 100 倍提取的 RNA 并比较所得 RT-qPCR 结果以及使用商业试剂盒来评估抑制作用。应按照制造商的说明遵循每个抑制控制套件的说明。

废水样品的标准差为1.91%-13.98%，一式三份为3.05×103至2.83×108个基因拷贝/L，空气样品的标准差为6.17×103至5.48×109，重复之间的标准差为0.54%-10.95%。这与以前的研究6,48,49,50一致。

如该协议所述，对样品进行测序， 表4 和 图1中总结了三个测序样品结果的示例。在所有三个样本中，谱系 BA.5.x 被 Freyja 工具指定为最普遍的（95.3%、95.4% 和 99.8%）。

Figure 1
图 1：选定废水样本中的 SARS-CoV-2 谱系流行率。 使用 Freyja 工具分配谱系。患病率数字的总和不一定达到100%，因为一些数据的质量不够。 请点击这里查看此图的较大版本.

表 1：每种试剂和每种试剂的体积，以制备用于通过 RT-qPCR 定量 SARS-CoV2 的预混液。请按此下载此表格。

表 2：每种试剂和每种试剂的体积，以制备预混液以扩增样品中的完整 SARS-CoV-2 基因组。请按此下载此表格。

表3：废水和空气样本中SARS-CoV-2 RNA的RT-qPCR定量结果摘要。 N1基因用于定量，N2基因用于确认（阳性或阴性）。结果以份数/L表示。 请按此下载此表格。

表 4：检测到的突变和谱系流行率。使用 Freyja 工具并根据使用 Nextclade 发现的感兴趣的突变分配谱系。 图中显示了每个样本的基因组覆盖率。患病率数字的总和不一定达到100%，因为一些数据的质量不够。 请按此下载此表格。

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Discussion

使用（RT-）qPCR方法进行微生物和病毒检测和定量分析因其卓越的灵敏度而获得了广泛的认可。然而，这些技术在分析环境样品时面临许多挑战。废水样品中含有大量的抑制性物质，这些物质可能会扭曲测量结果并产生误导性结果。为了解决这些限制并提高精度，构思、设计和实施了一个复杂的协议。该协议是通过结合科学文献中的协议而量身定制的，并通过在过程的每个阶段采用一系列严格的控制措施来专门解决qPCR方法中固有的限制。通过整合这些严格的质量控制措施，该协议为基于qPCR的检测和定量方法在复杂环境样品中面临的挑战提供了强大的解决方案51,52。分离阴性对照 （NCI） 和非模板对照 （NTC） 是评估 RNA 提取和 RT-qPCR 反应过程中污染可能性的重要工具。此外，月胚病毒对照RNA的整合为评估样品间变异性、浓缩步骤的效率和复杂环境样品中存在的试剂的抑制作用提供了重要手段。在每个RT-qPCR反应中，必须包括阳性对照，以确认扩增过程的有效性。仔细监控协议的每个步骤至关重要，包括样品的存储和处理时间。样品的降解会受到温度和废水复杂成分的影响，因此必须将样品储存在4°C的温度下，并在24小时内进行处理。通过遵守这些严格的质量控制措施，研究人员和公共卫生工作者可以自信而准确地分析环境样本，以揭示微生物和病毒种群的重要见解，并更好地了解环境因素对人类健康的影响48.

SARS-CoV-2检测RNA靶标的选择是影响RT-qPCR检测灵敏度的关键因素。在这项研究中，作者评估了 RdRp、E、N1 和 N2 靶标，发现 RdRp 和 E 检测的灵敏度低于 N1 和 N2 检测，与之前的研究一致53。N1 和 N2 检测使用双淬灭探针，已被证明在 （RT-）qPCR 检测中可提高其灵敏度54。这些原因导致决定使用 N1 进行定量，并使用 N2 作为 RNA 存在的确认，以便在发现非常低的浓度时消除疑虑。先前报道了观察到的RT-qPCR靶标之间的差异36。

几项研究采用了类似的方案，并报告了在正在进行的 COVID-19 大流行期间成功检测和定量废水中的 SARS-CoV-2 RNA6、48、49、55、56。报告的 SARS-CoV-2 RNA 浓度与本研究和方案48、50、55 中报告的浓度一致。其中一些研究探讨了活跃病例与RT-qPCR靶基因浓度之间的关系，特别是N1和N2 6,36,49,50,55,57,58,59。为了减少所获得的基因浓度的变异性，建议将实验浓度乘以采样时的流速，以获得初始病毒载量36。这种方法已被纳入西班牙的 VATar COVID-19 项目，这是一个针对废水中 COVID-19 的国家监测系统60。

作为 COVID-19 废水流行病学 （WBE） 研究的下一阶段，研究人员试图检测废水中的 SARS-CoV-2 突变，以估计社区内关注变体的传播情况。先前的研究表明，在废水中发现的变异与同时存在于人群中的变异之间存在很强的相关性。这些发现表明，基于废水的监测可以作为追踪SARS-CoV-2变体传播的宝贵工具61,62。WBE在监测SARS-CoV-2方面显示出巨大的前景，可用于制定未来的大流行监测策略。这种方法在大流行的早期阶段特别有用，此时个体检测有限，许多病例可能无症状，并且是临床监测的补充策略。因此，WBE在经济能力低下、负担不起其他更昂贵的监视策略的地方特别有用。所描述的方法可以很容易地适应将来可能与监测相关的其他病毒。

室内和室外环境中的空气采样结果显示，SARS-CoV-2 RNA存在于两种环境中，尽管在室外环境中的浓度较低38,63,64。这些发现表明，难以佩戴口罩和保持社交距离的活动和接触，如进食、饮水或参加音乐节，可能会造成更高的COVID-19传播风险。为了减轻这些风险，考虑适当的通风措施和使用口罩至关重要，尤其是在出现传播性更强的新变种的情况下，例如德尔塔（B.1.617.2）和奥密克戎（B.1.1.529）变种。鉴于许多地区取消了 COVID-19 限制，建议继续使用口罩，以将 SARS-CoV-2 的社区传播保持在最低限度，并防止未来爆发该疾病 5,21,26,65。

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Disclosures

作者没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。

Acknowledgments

这项工作是在卡斯蒂利亚-莱昂地区政府和FEDER计划（CLU 2017-09，UIC315和VA266P20项目）的财政支持下进行的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit

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References

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环境科学，第 196 期，SARS-CoV-2，RNA，RT-qPCR，测序，关注的变异株
废水和空气样本中SARS-CoV-2 RNA的定量和全基因组表征
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Gonçalves, J., Gomes da Silva, P., Koritnik, T., Bosilj, M., Torres-Franco, A., Diaz, I., Rodriguéz, E., Marcos, E., Mesquita, J. R., García-Encina, P. Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples. J. Vis. Exp. (196), e65053, doi:10.3791/65053 (2023).

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