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Quantification et caractérisation du génome entier de l’ARN du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées et les échantillons d’air

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65053
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 3, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4,5, 1,2
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

Ce protocole vise à quantifier l’ARN du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées et les échantillons d’air destinés à être utilisés pour des études épidémiologiques basées sur les eaux usées et à évaluer le risque d’exposition au SRAS-CoV-2 dans les aérosols intérieurs et extérieurs. Ce protocole décrit également une approche de séquençage à matrice longue d’amplicon en mosaïque pour la caractérisation du génome entier du SRAS-CoV-2.

Abstract

L’épidémiologie basée sur les eaux usées est apparue comme un système de surveillance prometteur et efficace du SRAS-CoV-2 et d’autres maladies infectieuses dans de nombreux pays. Le processus implique généralement la concentration des eaux usées, l’extraction d’acides nucléiques, l’amplification de segments génomiques sélectionnés, ainsi que la détection et la quantification du segment génomique amplifié. Cette méthodologie peut également être utilisée pour détecter et quantifier les agents infectieux, tels que le SRAS-CoV-2, dans les échantillons d’air. Initialement, on a présumé que le SRAS-CoV-2 se propageait principalement par contact personnel étroit avec des gouttelettes générées par une personne infectée en parlant, en éternuant, en toussant, en chantant ou en respirant. Cependant, un nombre croissant d’études ont signalé la présence d’ARN du SRAS-CoV-2 dans l’air des établissements de santé, établissant la transmission par voie aérienne comme une voie viable pour le virus. Cette étude présente un ensemble de protocoles établis pour faciliter la détection, la quantification et le séquençage des virus dans l’environnement à partir d’échantillons d’eaux usées et d’air.

Introduction

En décembre 2019, une nouvelle maladie appelée COVID-19 est apparue, causée par un coronavirus jusque-là inconnu, le SRAS-CoV-21. La pandémie mondiale qui en a résulté a représenté un défi de taille pour les laboratoires cliniques et de santé publique du monde entier, car un grand nombre de personnes ont besoin de tests pour évaluer avec précision la transmission et la prévalence du virus dans la communauté. Cependant, dans de nombreuses régions, il est économiquement impossible d’atteindre le niveau nécessaire de tests en temps opportun et de manière spatialement complète 2,3. Les systèmes de surveillance actuels, basés sur des diagnostics cliniques individuels, dépendent fortement de la gravité des symptômes et de la déclaration individuelle, ainsi que de la mesure dans laquelle ces symptômes se chevauchent avec les maladies existantes circulant dans la population 4,5,6,7,8,9,10. Par conséquent, un nombre élevé de cas asymptomatiques contribue à une sous-estimation significative de la charge de morbidité 7,11.

En raison de ces défis, l’épidémiologie basée sur les eaux usées (WBE) pour la surveillance de la COVID-19 a été proposée comme stratégie de surveillance complémentaire. Le WBE a été décrit pour la première fois en 200112 et a d’abord été utilisé pour retracer la cocaïne et d’autres drogues illégales13. Cette approche repose sur l’hypothèse qu’il est possible de calculer la concentration initiale de toute substance stable dans les eaux usées et excrétée par l’homme 8,12. WBE a été mis en œuvre avec succès dans de nombreux pays en tant que système de surveillance complémentaire et efficace du SRAS-CoV-2 3,8,14,15,16. La majorité des méthodes de détection des virus humains en milieu aquatique suivent les étapes suivantes : concentration, extraction des acides nucléiques, amplification du ou des segments génomiques choisis, et détection/quantification du segment génomique amplifié3.

Un autre environnement important pour la détection et la quantification du SRAS-CoV-2 est celui des échantillons d’air. Initialement, on pensait que le SRAS-CoV-2 se transmettait principalement par contact personnel étroit avec des gouttelettes respiratoires provenant d’aérosols générés par une personne infectée en parlant, en éternuant, en toussant, en chantant ou en respirant17. Cependant, plusieurs études ont commencé à signaler la présence d’ARN du SRAS-CoV-2 dans l’air, en particulier dans les établissements de santé et autres espaces clos 18,19,20,21. Des preuves de viabilité du SRAS-CoV-2 dans des échantillons d’air prélevés à l’intérieur des hôpitaux et d’autres espaces clos ont été trouvées lorsque la concentration du virus était suffisamment élevée22,23,2 4. Les études en plein air n’ont généralement trouvé aucune preuve de la présence du SRAS-CoV-2, sauf dans les espaces extérieurs bondés 21,25,26,27,28,29. À l’heure actuelle, la transmission aérienne du SRAS-CoV-2 a été reconnue comme un mode de transmission30,31. Une étude récente montre les différences entre l’extérieur, où les risques de transmission par voie aérienne sont minimes à l’extérieur des zones surpeuplées, et l’intérieur, où des risques plus importants pourraient être présents dans des environnements mal ventilés dans lesquels des sources fortes (c’est-à-dire le nombre de personnes infectées) pourraient être présentes. Une étude approfondie récente a mis en évidence les différences substantielles entre les risques de transmission par voie aérienne dans les environnements extérieurs et intérieurs, en particulier dans les zones surpeuplées où la ventilation est faible. L’étude indique que le risque de transmission par voie aérienne est minime dans les environnements extérieurs, où il y a un plus grand volume d’air disponible pour la dilution et la dispersion des particules virales32. Ces résultats ont des implications importantes pour les politiques et les directives de santé publique liées à la COVID-19. En reconnaissant les différences significatives dans les risques de transmission entre les environnements intérieurs et extérieurs, les décideurs peuvent élaborer des stratégies plus efficaces pour atténuer la propagation du virus et protéger la santé publique.

Il existe une variété de méthodes et de protocoles pour la détection, la quantification et le séquençage du SRAS-CoV-2 à partir de différents échantillons environnementaux. Cet article sur la méthode vise à présenter une combinaison de protocoles bien établis qui permettent à des laboratoires ayant différents niveaux de capacité d’effectuer la détection, la quantification et le séquençage environnementaux des virus à partir d’échantillons d’eaux usées et d’air.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été publiées ailleurs et contiennent de petites modifications par rapport aux méthodes originales.

1. Collecte des eaux usées et prétraitement des échantillons

REMARQUE : En raison des faibles concentrations d’ARN du SRAS-CoV-2 dans les échantillons environnementaux, la mise en œuvre d’une étape de concentration est cruciale pour une détection réussie33,34,35. Il s’agit de la première méthode de détection du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées36.

  1. Prélèvement et concentration d’échantillons d’eaux usées
    1. Prélever 1 L d’échantillon d’eaux usées composites sur 24 h. Conservez l’échantillon à 4 °C et procédez au protocole dans les 24 heures.
    2. Homogénéisez l’échantillon en agitant doucement le flacon. Prélever 70 mL dans un tube centrifuge de 100 mL ou diviser l’échantillon en deux tubes centrifuges de 50 mL.
    3. Augmenter de 20 μL de mengovirus (3,2 x 10,3 copies/μL) dans 70 mL de chaque échantillon comme contrôle interne du processus de concentration. Vous pouvez également injecter 10 μL de mengovirus (3,2 x 103 copies/μL) dans chaque tube à centrifuger de 50 mL.
    4. Homogénéiser l’échantillon et centrifuger à 700 x g pendant 10 min pour éliminer les grosses particules et les organismes (pastilles).
    5. Utiliser le surnageant obtenu pour la concentration avec des dispositifs d’ultrafiltration centrifuge avec un seuil de coupure de 10 KDa en centrifugeant à 4 000 x g pendant 40 min à 4 °C. Éluer le concentré en centrifugeant à 700 x g pendant 40 min et en inversant la position du dispositif d’ultrafiltration.
    6. Mesurez le volume du concentré obtenu. Le volume changera en fonction de la quantité de solides dans l’échantillon qui obstruent les filtres centrifuges. Dans cette étude, les volumes de concentré obtenus se situaient entre 200 et 1 200 μL.
    7. Utilisez le concentré obtenu pour l’extraction de l’ARN à l’aide d’un kit commercial ou d’une méthode interne. Pour les échantillons utilisés dans cette étude, un kit commercial spécifique pour l’extraction de l’ARN viral avec un volume d’élution de 50 μL est utilisé.
    8. Mesurez la concentration de l’ARN extrait à l’aide d’un kit de quantification de l’ARN fluorométrique. Diviser l’ARN extrait en aliquotes et congeler à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.
      NOTA : Pour chaque ensemble de procédures d’isolement de l’ARN, un contrôle négatif de l’isolement (NCI) doit être inclus, contenant uniquement des tampons pour détecter une éventuelle contamination pendant l’extraction.
  2. Prélèvement d’échantillons d’air à l’aide d’un échantillonneur d’air compact Coriolis
    1. Choisissez une stratégie d’échantillonnage en fonction de l’objectif de la recherche en définissant la fréquence d’échantillonnage et les lieux d’échantillonnage.
    2. Réglez le débit sur l’échantillonneur d’air (ici, 50 L/min pendant 30 min). Veuillez noter qu’un débit supérieur à 200 L/min peut dégrader l’ARN viral, il est donc recommandé d’utiliser un débit inférieur à 200 L/min.
    3. Placez un cône stérile dans l’échantillonneur d’air avant de commencer le prélèvement en pulsant le démarrage. Une fois l’échantillonnage terminé, ajoutez 5 à 15 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) dans le cône. Agitez doucement l’échantillon à la main pendant 15 s. Conservez les échantillons jusqu’à 24 h à 4 °C ou à -80 °C dans des cryotubes.
    4. Une étape de concentration facultative peut être effectuée. Nettoyez et décontaminez les cônes après chaque expérience à l’aide d’eau de Javel.
    5. Extraire l’ARN à l’aide d’un kit commercial ou d’une méthode interne. Pour les échantillons de cette étude, un kit commercial spécifique pour l’extraction de l’ARN viral avec un volume d’élution de 50 μL est utilisé.
    6. Mesurez la concentration de l’ARN extrait à l’aide d’un kit de quantification de l’ARN fluorométrique. Diviser l’ARN extrait en aliquotes et congeler à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.
      NOTA : Pour chaque ensemble de procédures d’isolement de l’ARN, un contrôle négatif de l’isolement (NCI) doit être inclus, contenant uniquement des tampons pour détecter une éventuelle contamination pendant l’extraction.

2. Quantification de l’ARN du SARS-CoV-2 par réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (RT-qPCR)

REMARQUE : Le protocole ci-dessous est conforme au panel de diagnostic RT-PCR37 du CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV). Divisez le mélange amorce/sonde en plusieurs aliquotes pour éviter les cycles de congélation et de décongélation.

  1. Préparer le mélange principal de réactions pour chaque cible (mengovirus ; SARS-CoV-2 [gènes N1 et N2]) comme dans le tableau 1, dans une hotte propre dans la salle d’installation des réactifs. Mélangez le mélange amorces/sonde et l’enzyme par inversion cinq fois. Alternativement, le vortex d’impulsion de lumière le mélange d’amorces / sonde et l’enzymecinq fois.
    REMARQUE : Gardez tous les réactifs au froid pendant la préparation et l’utilisation. Afin de minimiser les cycles de gel-dégel, il est fortement recommandé de congeler en aliquotes.
  2. Essorez (1 000 x g pendant 15 à 30 s) les tubes pour recueillir le contenu au fond et placez les tubes dans une grille froide ou sur de la glace.
  3. Étiqueter les tubes de microcentrifugation de 1,5 ml pour chaque cible. Ajouter à chaque tube de microcentrifugation la quantité de chaque réactif nécessaire (volume par réaction, fois le nombre de réactions, y compris les contrôles nécessaires). Mélanger en pipetant de haut en bas et centrifuger pendant 5 s pour recueillir le contenu au fond.
  4. Conservez les tubes de microcentrifugation dans une grille froide et distribuez 15 μL dans des tubes PCR en bandelette ou une plaque à 96 puits dans une grille de refroidissement. Couvrez la plaque et déplacez-la dans la zone de manipulation des acides nucléiques (conservez-la dans une grille de refroidissement).
  5. Décongeler une aliquote d’ARN extrait et tourbillonner doucement pendant 5 s. Pipeter 5 μL d’ARN (en plus de 5 μL de témoin sans matrice [NTC], de contrôle négatif d’isolement [NCI] et de contrôle positif [PC]) dans chaque puits de réaction ou tube contenant le mélange maître préalablement préparé. Changez souvent de gants au besoin pour éviter la contamination croisée.
  6. Couvrez l’ensemble de la plaque ou des tubes de réaction et tourbillonnez doucement. Centrifuger (1 000 x g pendant 15-30 s) la plaque ou les tubes PCR.
  7. Démarrer la RT-qPCR de 25 μL avec les conditions de cyclage suivantes : transcriptase inverse à 45 °C pendant 10 min ; activation de la polymérase à 95 °C pendant 10 min ; 45 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 15 s ; et recuit/extension à 60 °C pendant 45s.
  8. Calculer l’efficacité de récupération des contrôles du mengovirus telle que rapportée par Conte et al.38 :
    Equation 1 × 100

3. Variantes de séquençage dans les eaux usées et analyse des données

NOTE : Le protocole décrit est un protocole modifié créé par Quick et al.39,40. Il utilise deux ensembles d’amorces pour l’amplification du génome du SRAS-CoV-2 par la méthodologie de pavage PCR : les amorces ARTIC et les amorces VarSkip. Une combinaison d’amorces est utilisée pour garantir la meilleure couverture du génome et pour minimiser la possibilité de nouvelles mutations entraînant l’échec d’amorces d’un type. En général, le protocole est divisé en trois parties : la transcription inverse (RT) et la génération d’amplicons, la préparation de la bibliothèque de séquençage, et le séquençage et l’analyse des données.

  1. Transcription inverse et génération d’amplicon
    1. Assurez-vous que les échantillons d’entrée ont une valeur connue de seuil de cyclage (Ct) qPCR pour les diluer correctement dans de l’eau de qualité PCR. La valeur Ct est obtenue lors de la quantification par qPCR. Les dilutions sont les suivantes : si la valeur Ct est comprise entre 12 et 15, diluer les échantillons à 1 :100 ; si la valeur Ct est comprise entre 15 et 18, diluer les échantillons 1 :10 ; si la valeur Ct est comprise entre 18 et 35, ne diluez pas l’échantillon. Les échantillons au-dessus d’une valeur Ct de 35 ont de fortes chances de ne pas fonctionner.
    2. Dans une plaque PCR, pipeter 16 μL de chaque échantillon jusqu’à sa position sur la plaque. Ajouter 4 μL de mastermix de transcription inverse (RT) (5x). Couvrez la plaque et démarrez la réaction PCR dans les conditions suivantes : 25 °C pendant 2 min, 55 °C pendant 20 min et 95 °C pendant 1 min.
    3. Préparez des dilutions de 10 μM de chaque ensemble d’amorces (ARTIC pool A et pool B, et VarSkip pool A et pool B). Préparez le mélange principal pour chaque jeu d’amorces (ensemble ARTIC A et B, et ensemble VarSkip A et B) comme dans le tableau 2. Quatre mastermixes en découleront.
    4. Sur une nouvelle plaque PCR, pipeter 20 μL du mastermix dans chaque puits correspondant. Ajouter 5 μL de l’échantillon RT à chaque mélange.
      REMARQUE : Chaque échantillon comportera quatre mélanges réactionnels : les groupes A et B de l’ARTIC et les groupes A et B de VarSkip.
    5. Couvrir la plaque et démarrer la réaction PCR comme suit : activation de la polymérase à 98 °C pendant 30 s ; 35 cycles de dénaturation à 98 °C pendant 15 s ; et recuit/extension à 65 °C pendant 4 min. Essorez (1 000 x g pendant 15 à 30 s) la plaque. Combinez les pools de réaction ARTIC et combinez séparément les pools de réaction VarSkip. Chaque échantillon aura deux réactions d’amplicon de 50 μL.
    6. Ajouter 50 μL de réactif à base de billes pour la purification par PCR dans chaque puits et bien mélanger par pipetage. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
      REMARQUE : Avant chaque utilisation, mélangez vigoureusement le réactif de purification PCR pour remettre les billes en suspension.
    7. Placez la plaque sur un support de séparation magnétique et attendez que les billes forment une pastille et que le liquide s’éclaircisse (~5 min). Pipeter et jeter le surnageant. Conservez la plaque PCR sur le support magnétique.
    8. En maintenant la plaque PCR sur le support magnétique, ajoutez 200 μL d’éthanol à 80 % à chaque échantillon sans toucher la pastille de bille. Retirez l’éthanol.
    9. Répétez l’étape précédente. Laissez la plaque sur le support magnétique à découvert pendant 30 s pour permettre à l’éthanol de s’évaporer.
    10. Retirez la plaque du support magnétique et ajoutez 15 μL d’eau de qualité PCR à chaque échantillon. Remettre le granulé en suspension par pipetage. Incuber à température ambiante pendant 2 min.
    11. Replacez la plaque sur le support magnétique et laissez les perles s’agglutiner (2 min). Pipeter soigneusement 15 μL de surnageant de chaque échantillon sur une nouvelle plaque PCR.
    12. Mesurez la concentration de chaque échantillon à l’aide d’un kit de quantification de l’ARN fluorométrique. Prélever environ 50 ng de chaque échantillon dans 12,5 μL à l’étape suivante. Si nécessaire, diluez l’échantillon dans de l’eau de qualité PCR.
  2. Préparation de la bibliothèque
    1. Ajoutez 1,75 μL de tampon réactionnel du kit de préparation de la banque d’ADN Illumina et 0,75 μL de mélange enzymatique à chaque échantillon. Couvrir brièvement la plaque, tourbillonner et faire tourner vers le bas (1 000 x g pendant 15 à 30 s). Incuber à 21°C pendant 5 min et à 65 °C pendant 5 min.
    2. Dans une nouvelle plaque, pipeter 3 μL d’eau de qualité PCR pour chaque échantillon dans une nouvelle plaque PCR. Ajouter 0,75 μL des échantillons préparés, 1,25 μL de codes-barres pour la préparation de la bibliothèque de séquençage et 5 μL de mélange maître d’ADN ligase T4. Bien mélanger par pipetage, essorer brièvement (1 000 x g pendant 15 à 30 s) dans une centrifugeuse et incuber à 21 °C pendant 20 min et à 65 °C pendant 10 min.
      REMARQUE : Si vous utilisez moins de 25 échantillons, doublez tous les volumes à cette étape.
    3. Regroupez tous les échantillons en ajoutant 10 μL de chaque échantillon dans le même tube à faible liaison. Passez à l’étape suivante avec 480 μL.
    4. Ajouter 192 μL de réactif à base de billes pour la purification par PCR dans le pool et bien mélanger par pipetage. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
    5. Placez le tube sur un support magnétique et attendez que le surnageant se dégage et qu’une pastille de bille se forme. Retirez le surnageant. Retirez le tube du support magnétique.
    6. Ajouter 700 μL de tampon à fragments courts (SFB) et mélanger par pipetage. Replacez-le sur le support magnétique et attendez que la pastille se forme et que le liquide s’éclaircisse (~5 min). Pipeter le surnageant et le jeter.
    7. Répétez l’étape précédente. Laissez le tube sur le support magnétique. Ajouter 100 μL d’éthanol à 80 % sans toucher le billet. Pipeter l’éthanol et laisser sécher le cordon pendant 30 s.
      REMARQUE : Ne laissez pas la perle trop sécher.
    8. Retirez le tube du support magnétique et ajoutez 35 μL d’eau de qualité PCR. Mélanger par pipetage et incuber à température ambiante pendant 2 min. Placez le tube sur le support magnétique et laissez la perle s’agglutiner et le liquide s’éclaircir. Pipeter 35 μL du surnageant dans un nouveau tube.
    9. Mesurez la concentration d’ARN de la banque regroupée. Pipetez le volume nécessaire pour atteindre une quantité de 30 à 50 ng d’ARN et remplissez-le d’eau de qualité PCR pour atteindre un volume final de 30 μL.
    10. Préparer le mélange réactionnel de ligature de l’adaptateur : 30 μL de la bibliothèque regroupée, 5 μL de l’Adapter Mix II, 10 μL du tampon de réaction de ligature (5x) et 5 μL de l’ADN ligase T4. Mélanger par pipetage et essorage (1 000 x g pendant 15 à 30 s). Incuber à température ambiante pendant 10 min.
    11. Ajouter 20 μL du réactif à base de billes pour la purification par PCR et mélanger par pipetage. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
    12. Placez le tube sur le support magnétique et attendez que la pastille de bille se forme et que le surnageant devienne incolore. Pipeter soigneusement et jeter le surnageant.
    13. Retirer du support magnétique et ajouter 125 μL de SFB. Mélangez par pipetage et replacez sur le support magnétique pour séparer les billes. Lorsque le liquide est clair, pipetez et jetez le surnageant.
    14. Répétez l’étape précédente. Laissez le tube ouvert sur le support magnétique pendant 30 s pour qu’une partie du liquide restant s’évapore.
    15. Retirez le tube du support magnétique et ajoutez 15 μL de tampon d’élution. Bien mélanger en pipetant et essorer brièvement (1 000 x g pendant 15 à 30 s). Incuber à température ambiante pendant 5 min. Placez-le sur le support magnétique pendant 2 min.
    16. Pipeter 15 μL de surnageant dans un nouveau tube à faible liaison. Il s’agit de la bibliothèque finale. Mesurez la concentration à l’aide d’un kit de quantification de l’ADN fluorométrique.
      REMARQUE : À l’étape suivante, 12 μL sont nécessaires. Si la concentration est très élevée et que moins de 12 μL de la bibliothèque sont nécessaires, remplir jusqu’à 12 μL avec le réactif tampon d’élution.
  3. Chargement et séquençage des cellules d’écoulement
    1. Insérez la cellule d’écoulement (R9.4.1) dans le dispositif de séquençage de l’ADN et de l’ARN en temps réel.
    2. Préparez le mélange d’amorçage en ajoutant 30 μL de réactif d’attache de rinçage (FLT) à un tube de réactif tampon de rinçage (FB). Vortex à mélanger et à faire tourner vers le bas (1 000 x g pendant 15 à 30 s).
    3. Ouvrez le couvercle de l’orifice d’amorçage. À l’aide d’une pipette de 1 000 μL, réglez sur 200 μL et insérez l’embout dans l’orifice d’amorçage. Tournez la molette de réglage du volume et augmentez le volume jusqu’à ce que le liquide dans l’embout soit visible. Jetez l’embout.
      REMARQUE : Ne tournez la roue que jusqu’à ce que quelques μL de liquide dans la pointe soient visibles. Le fait de tirer de plus grandes quantités pourrait endommager la cellule d’écoulement.
    4. Ajouter lentement 800 μL du mélange d’amorçage dans l’orifice d’amorçage, en prenant soin de ne pas introduire de bulles. Attendez 5 min.
    5. En attendant, préparez les bibliothèques pour le chargement. Mélangez 37,5 μL du tampon de séquençage, 25,5 μL du tampon de chargement et 12 μL de la bibliothèque.
      REMARQUE : Mélangez le tampon de chargement avant le pipetage. Les billes de ce réactif se déposent très rapidement.
    6. Ouvrez le couvercle du port. Pipeter 200 μL du mélange d’amorçage dans l’orifice d’amorçage.
      REMARQUE : Lors du pipetage dans l’orifice d’amorçage avec l’orifice de couvercle ouvert, on remarquera de petites gouttes provenant de l’orifice d’échantillonnage. Pipetez assez lentement pour que l’orifice d’échantillonnage puisse aspirer les gouttes sans déborder.
    7. Avant de charger la bibliothèque préparée, bien mélanger par pipetage. À l’aide d’une pipette de 100 μL réglée sur 75 μL, prélevez la bibliothèque et la pipette goutte à goutte dans l’orifice d’échantillonnage. Ne touchez pas l’orifice et attendez que chaque goutte soit absorbée dans l’orifice avant de charger la goutte suivante pour éviter le débordement du liquide.
    8. Fermez l’orifice de capot et l’orifice d’amorçage. Ouvrez le logiciel et lancez l’expérience de séquençage. Sélectionnez l’appel de base activé. Pour une bibliothèque de 96 échantillons multiplexés, 10 à 12 h de séquençage suffisent généralement pour générer suffisamment de données.
      REMARQUE : À l’aide du logiciel, on peut insérer la feuille d’échantillon au format .csv. La feuille d’échantillons nécessite les données suivantes : flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code et kit. L’ID de la cellule d’écoulement est nécessaire (indiqué sur le côté de la cellule d’écoulement) ainsi que le kit utilisé. Pour le protocole suggéré, le kit LSK109 doit être sélectionné.
  4. Analyse des données de séquençage
    1. Insérez les lectures fastq compressées dans le flux de travail wf-artic41. Exécutez le flux de travail séparément avec deux schémas d’amorce différents (ARTIC/V4.1 et NEB-VarSkip/v1a). Deux « . primertrimmed.rg.sorted.bam » sont créés pour chaque échantillon.
    2. Fusionnez les fichiers BAM en un seul fichier avec la commande « samtools merge »42. Insérez le fichier BAM fusionné dans l’outil Freyja, en laissant les paramètres par défaut, pour récupérer les abondances relatives de la lignée43.
    3. Pour créer un fichier FASTA, insérez le fichier BAM fusionné dans les outils « samtools mpileup » et « ivar » avec les paramètres par défaut44,45. Pour l’appel de mutation, chargez le fichier FASTA dans l’outil Nextclade46,47.

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Representative Results

Les résultats résumés dans le tableau 3 montrent des exemples de détection et de quantification de l’ARN du SRAS-CoV-2 dans des échantillons d’eaux usées et d’air à l’aide de la méthode décrite dans cet article. Des échantillons d’eaux usées ont été prélevés dans des stations d’épuration en Espagne et en Slovénie et ont été considérés comme positifs si le Ct était inférieur à 40 dans au moins deux des trois répétitions, la quantification étant considérée comme valide si le Ct présentait une variation inférieure à 5 %. En Espagne et au Portugal, des échantillons d’air intérieur et extérieur ont été prélevés et les mêmes règles ont été appliquées. Des doublons ont été utilisés pour les échantillons d’air, et non des triples comme pour les échantillons d’eaux usées, car le but de l’étude était de détecter l’ARN du SARS-CoV-2 et non de le quantifier. De plus, une RT-qPCR n’a été considérée comme valide que si tous les contrôles utilisés (tels que décrits dans ce protocole) se sont comportés comme prévu et si aucun écart significatif n’a été observé dans le contrôle de l’ARN du mengovirus. Pour ces échantillons, l’efficacité de récupération du mengovirus variait entre 13,7 % et 19,7 %. L’inhibition a été évaluée en diluant l’ARN extrait dix fois et 100 fois et en comparant les résultats de la RT-qPCR résultante, ainsi qu’en utilisant un kit commercial. Les instructions de chaque trousse de contrôle de l’inhibition doivent être suivies telles que décrites par les fabricants.

Les échantillons d’eaux usées présentaient un écart-type de 1,91 % à 13,98 % parmi les échantillons triplés et variaient de 3,05 x 10 3 à 2,83 x 108 copies de gènes/L. Les échantillons d’air variaient de 6,17 x 103 à 5,48 x 109 avec un écart-type entre les doublons compris entre 0,54 % et 10,95 %. Ceci est conforme aux études précédentes 6,48,49,50.

Comme il est décrit dans le présent protocole, les échantillons ont été séquencés et un exemple de trois résultats d’échantillons séquencés est résumé dans le tableau 4 et la figure 1. Dans les trois échantillons, la lignée BA.5.x a été désignée comme la plus répandue par l’outil Freyja (95,3 %, 95,4 % et 99,8 %).

Figure 1
Figure 1 : Prévalence de la lignée du SRAS-CoV-2 dans certains échantillons d’eaux usées. Les lignées ont été attribuées à l’aide de l’outil Freyja. Le résumé des chiffres de prévalence n’atteint pas nécessairement 100 %, car certaines données ne sont pas de qualité suffisante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Réactifs et volumes à ajouter de chacun pour préparer le mélange-maître pour la quantification du SARS-CoV2 par RT-qPCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Réactifs et volumes à ajouter de chacun pour préparer le mélange maître afin d’amplifier les génomes complets du SRAS-CoV-2 dans les échantillons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Résumé des résultats de la quantification RT-qPCR de l’ARN du SRAS-CoV-2 à partir d’échantillons d’eaux usées et d’air. Le gène N1 a été utilisé pour la quantification et le gène N2 a été utilisé pour la confirmation (positive ou négative). Les résultats sont exprimés en copies/L. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : Mutations détectées et prévalence de la lignée. Les lignées ont été attribuées à l’aide de l’outil Freyja et en fonction des mutations d’intérêt trouvées à l’aide de Nextclade. La couverture génomique de chaque échantillon est indiquée. Le résumé des chiffres de prévalence n’atteint pas nécessairement 100 %, car certaines données ne sont pas de qualité suffisante. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

La détection et la quantification microbiennes et virales à l’aide de méthodes de (RT-)qPCR ont été largement acceptées en raison de leur sensibilité remarquable. Cependant, ces techniques se heurtent à de nombreux défis lors de l’analyse d’échantillons environnementaux. Les échantillons d’eaux usées contiennent une abondance de substances inhibitrices qui peuvent fausser les mesures et générer des résultats trompeurs. Pour remédier à ces limitations et améliorer la précision, un protocole complexe a été conçu, conçu et mis en œuvre. Ce protocole a été conçu en combinant des protocoles de la littérature scientifique et pour répondre spécifiquement aux restrictions inhérentes aux méthodes de qPCR en incorporant une série de contrôles rigoureux à chaque étape du processus. En intégrant ces mesures rigoureuses de contrôle de la qualité, ce protocole offre une solution robuste aux défis rencontrés par les méthodes de détection et de quantification basées sur la qPCR dans des échantillons environnementaux complexes51,52. Le contrôle négatif de l’isolement (NCI) et le contrôle non-matrice (NTC) sont des outils essentiels pour évaluer la probabilité de contamination lors de l’extraction de l’ARN et de la réaction RT-qPCR. De plus, l’intégration de l’ARN de contrôle du mengovirus fournit un moyen crucial d’évaluer la variabilité inter-échantillons, ainsi que l’efficacité de l’étape de concentration et les effets inhibiteurs des agents présents dans des échantillons environnementaux complexes. Dans chaque réaction RT-qPCR, des contrôles positifs doivent être inclus pour confirmer l’efficacité du processus d’amplification. Il est essentiel de surveiller attentivement chaque étape du protocole, y compris le temps de stockage et de traitement des échantillons. La dégradation des échantillons peut être influencée par la température et la composition complexe des eaux usées, ce qui rend indispensable le stockage des échantillons à une température de 4 °C et leur traitement dans les 24 heures. En adhérant à ces mesures rigoureuses de contrôle de la qualité, les chercheurs et les travailleurs de la santé publique peuvent analyser avec confiance et précision des échantillons environnementaux afin de découvrir des informations vitales sur les populations microbiennes et virales et de mieux comprendre l’impact des facteurs environnementaux sur la santé humaine48.

La sélection des cibles d’ARN pour la détection du SRAS-CoV-2 est un facteur critique qui peut avoir un impact sur la sensibilité des tests RT-qPCR. Dans cette étude, les auteurs ont évalué les cibles RdRp, E, N1 et N2 et ont constaté que les tests RdRp et E avaient une sensibilité inférieure à celle des tests N1 et N2, conformément aux recherches antérieures53. Les tests N1 et N2 utilisent des sondes à double trempage, dont il a été démontré qu’elles améliorent leur sensibilité dans les tests (RT-)qPCR54. Ces raisons ont conduit à la décision d’utiliser N1 pour la quantification et N2 comme confirmation de la présence de l’ARN, afin d’éliminer les doutes lorsque de très faibles concentrations sont trouvées. Les écarts observés entre les cibles RT-qPCR ont déjà été signalés36.

Plusieurs études ont utilisé des protocoles similaires et ont rapporté la détection et la quantification réussies de l’ARN du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées pendant la pandémie de COVID-19 en cours 6,48,49,55,56. Les concentrations d’ARN du SRAS-CoV-2 rapportées sont conformes à celles rapportées dans cette étude et dans le protocole 48,50,55. Certaines de ces études ont exploré la relation entre les cas actifs et les concentrations de gènes cibles de la RT-qPCR, en particulier N1 et N2 6,36,49,50,55,57,58,59. Pour réduire la variabilité des concentrations de gènes obtenus, il a été proposé de multiplier les concentrations expérimentales par le débit au moment de l’échantillonnage pour obtenir la charge virale initiale36. Cette approche a été intégrée dans le projet VATar COVID-19 en Espagne, un système national de surveillance du COVID-19 dans les eaux usées60.

Dans le cadre de la prochaine phase des études d’épidémiologie des eaux usées liées à la COVID-19, les chercheurs ont tenté de détecter des mutations du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées afin d’estimer la circulation des variants préoccupants au sein des communautés. Des études antérieures ont montré une forte corrélation entre les variants identifiés dans les eaux usées et ceux présents dans la population au même moment. Ces résultats suggèrent que la surveillance basée sur les eaux usées pourrait servir d’outil précieux pour suivre la propagation des variants du SRAS-CoV-261,62. WBE s’est révélé très prometteur dans la surveillance du SRAS-CoV-2 et peut être utilisé pour l’élaboration de futures stratégies de surveillance des pandémies. Cette approche est particulièrement utile dans les premiers stades d’une pandémie, lorsque les tests individuels sont limités et que de nombreux cas peuvent être asymptomatiques, et a une stratégie complémentaire à la surveillance clinique. Par conséquent, l’EBM peut être particulièrement utile dans les endroits à faible capacité économique qui ne peuvent pas se permettre d’autres stratégies de surveillance plus coûteuses. La méthode décrite peut être facilement adaptée à d’autres virus qu’il pourrait être pertinent de surveiller à l’avenir.

Les résultats de l’échantillonnage de l’air dans les environnements intérieurs et extérieurs ont révélé que l’ARN du SRAS-CoV-2 est présent dans les deux environnements, bien qu’à des concentrations plus faibles dans les environnements extérieurs 38,63,64. Ces résultats suggèrent que les activités et les expositions dans lesquelles le port du masque et la distanciation sociale sont difficiles à maintenir, comme manger, boire ou assister à des festivals de musique, pourraient présenter un risque plus élevé de transmission de la COVID-19. Pour atténuer ces risques, il est essentiel d’envisager des mesures de ventilation appropriées et l’utilisation de masques, en particulier avec l’émergence de nouveaux variants préoccupants plus transmissibles, tels que les variants Delta (B.1.617.2) et Omicron (B.1.1.529). À la lumière de la levée des restrictions liées à la COVID-19 dans de nombreuses régions, il est recommandé de maintenir l’utilisation de masques afin de réduire au minimum la transmission communautaire du SRAS-CoV-2 et de prévenir de futures éclosions de la maladie 5,21,26,65.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas d’intérêts économiques concurrents ou d’autres conflits d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été réalisé avec le soutien financier du gouvernement régional de Castille-et-León et du programme FEDER (projets CLU 2017-09, UIC315 et VA266P20).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit

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References

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Sciences de l’environnement Numéro 196 SARS-CoV-2 ARN RT-qPCR séquençage variants préoccupants
Quantification et caractérisation du génome entier de l’ARN du SRAS-CoV-2 dans les eaux usées et les échantillons d’air
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