Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

廃水および大気サンプル中のSARS-CoV-2 RNAの定量と全ゲノム特性評価

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65053
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 3, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4,5, 1,2
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

このプロトコルは、廃水および空気サンプル中の SARS-CoV-2 RNA を定量化して、廃水ベースの疫学研究に使用し、屋内および屋外のエアロゾル中の SARS-CoV-2 への曝露リスクを評価することを目的としています。このプロトコルでは、SARS-CoV-2の全ゲノム特性評価のためのタイルアンプリコンロングテンプレートシーケンシングアプローチについても説明します。

Abstract

廃水ベースの疫学は、多くの国でSARS-CoV-2やその他の感染症の有望で効果的なサーベイランスシステムとして浮上しています。このプロセスは、典型的には、廃水濃縮、核酸抽出、選択されたゲノムセグメントの増幅、ならびに増幅されたゲノムセグメントの検出および定量を含む。この手法は、空気サンプル中のSARS-CoV-2などの感染性病原体を検出して定量するためにも同様に活用できます。当初、SARS-CoV-2は、主に感染者が話すとき、くしゃみをするとき、咳をするとき、歌うとき、呼吸するときに発生する飛沫との密接な接触によって広がると推定されていました。しかし、医療施設の空気中にSARS-CoV-2 RNAが存在することを報告する研究が増えており、空気感染がウイルスの実行可能な経路として確立されています。この研究は、廃水と空気サンプルの両方からのウイルスの環境検出、定量化、および配列決定を容易にするために確立されたプロトコルの複合体を示しています。

Introduction

2019年12月、これまで知られていなかったコロナウイルスであるSARS-CoV-2によって引き起こされるCOVID-19と呼ばれる新しい病気が出現しました1。その結果、世界的なパンデミックは、世界中の臨床および公衆衛生研究所に大きな課題をもたらしており、多くの個人がコミュニティでのウイルス感染と有病率を正確に評価するための検査を必要としています。しかし、多くの地域では、必要なレベルのテストをタイムリーかつ空間的に包括的な方法で達成することは、経済的に実現不可能です2,3。個々の臨床診断に基づく現在のサーベイランスシステムは、症状の重症度と個々の報告、およびこれらの症状が集団で循環している既存の疾患とどの程度重複しているかに大きく依存しています4,5,6,7,8,9,10。その結果、無症候性の症例数が多いことは、疾病負荷の著しい過小評価に寄与している7,11。

これらの課題により、COVID-19サーベイランスのための廃水ベースの疫学(WBE)が補完的なサーベイランス戦略として提案されました。WBEは2001年に初めて記述され12、当初はコカインやその他の違法薬物を追跡するために使用されていた13。このアプローチは、廃水中で安定し、人間によって排泄される物質の初期濃度を計算できるという仮定に依存しています8,12。WBEは、SARS-CoV-2 3,8,14,15,16の補完的かつ効率的なサーベイランスシステムとして、多くの国で導入に成功しています。水生環境でヒトウイルスを検出する方法の大部分は、濃縮、核酸抽出、選択したゲノムセグメントの増幅、および増幅されたゲノムセグメントの検出/定量3のステップに従います。

SARS-CoV-2の検出と定量のためのもう一つの重要な環境は、空気サンプル中です。当初、SARS-CoV-2は、主に感染者が発話、くしゃみ、咳、歌、呼吸中に発生するエアロゾルからの呼吸器飛沫との密接な個人的接触によって感染すると考えられていました17。しかし、いくつかの研究により、空気中、特に医療施設やその他の閉鎖された空間でのSARS-CoV-2 RNAの存在が報告され始めました18,19,20,21。SARS-CoV-2の生存率の証拠は、ウイルス濃度が十分に高かったときに、病院やその他の閉鎖空間の屋内で採取された空気サンプルで発見されました22,23,2 4。屋外での研究では、混雑した屋外スペースを除いて、一般的にSARS-CoV-2の証拠は見つかりませんでした21、25、26、27、28、29。現在のところ、SARS-CoV-2の空気感染は感染経路として認識されています30,31。最近のレビュー研究では、混雑した場所以外では空気感染のリスクが最小限に抑えられる屋外と、強い感染源(感染者数)が存在する可能性のある換気の悪い環境でより大きなリスクが存在する可能性のある屋内との違いが示されています。最近の包括的なレビュー研究では、屋外環境と屋内環境、特に換気の悪い混雑した場所での空気感染のリスクの大きな違いが強調されています。この研究は、ウイルス粒子の希釈と分散に利用できる空気の量が多い屋外環境では、空気感染のリスクが最小限に抑えられることを示している32。これらの知見は、COVID-19に関連する公衆衛生政策やガイドラインにとって重要な意味を持つ。屋内と屋外の感染リスクの大きな違いを認識することで、政策立案者はウイルスの蔓延を緩和し、公衆衛生を保護するためのより効果的な戦略を策定することができます。

さまざまな環境サンプルからのSARS-CoV-2の検出、定量、およびシーケンシングには、さまざまな方法とプロトコルがあります。この分析法の記事は、さまざまな能力レベルのラボが廃水および空気サンプルからのウイルスの環境検出、定量、およびシーケンシングを実行できるようにする、確立されたプロトコルの組み合わせを提示することを目的としています。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ここで説明するすべてのメソッドは他の場所で公開されており、元のメソッドから少し変更されています。

1.廃水の収集とサンプルの前処理

注:環境サンプル中のSARS-CoV-2 RNAの濃度が低いため、検出を成功させるには濃縮ステップの実施が重要です33,34,35。ここで説明するのは、廃水中のSARS-CoV-2を検出するための最初の報告された方法です36。

  1. 廃水サンプルの収集と濃縮
    1. 24時間複合廃水サンプルを1L採取します。サンプルを4°Cで保存し、24時間以内にプロトコルを進めます。
    2. ボトルを静かに振ってサンプルを均質化します。70 mLを100 mLの遠心チューブに集めるか、サンプルを50 mLの2本の遠心チューブに分けます。
    3. 濃縮プロセスの内部コントロールとして、20 μL のメンゴウイルス (3.2 x 103 コピー/μL) を各サンプルの 70 mL にスパイクします。あるいは、メンゴウイルス10 μL(3.2 x 103 コピー/μL)を各50 mL遠心チューブにスパイクします。
    4. サンプルを均質化し、700 x gで10分間遠心分離して、大きな粒子や生物(ペレット)を除去します。
    5. 得られた上清を、4°Cで40分間4,000 x g で遠心分離することにより、カットオフが10 KDaの遠心限外ろ過装置での濃縮に使用します。 700 x g で 40 分間遠心分離し、限外ろ過装置の位置を反転させて濃縮液を溶出します。
    6. 得られた濃縮物の体積を測定します。体積は、遠心フィルターを詰まらせるサンプル中の固形物の量に応じて変化します。この研究では、得られた濃縮液の量は200〜1,200μLでした。
    7. 得られた濃縮液は、市販のキットまたは社内の方法を使用してRNA抽出に使用します。この研究で使用したサンプルには、溶出量が 50 μL のウイルス RNA 抽出用の特定の市販キットを使用します。
    8. 抽出したRNAの濃度を蛍光RNA定量キットで測定します。抽出したRNAをアリコートに分割し、さらに分析するまで-80°Cで凍結します。
      注:各 RNA 単離手順セットには、抽出中のコンタミネーションの可能性を検出するためのバッファーのみを含むネガティブコントロール(NCI)を含める必要があります。
  2. コリオリコンパクトエアサンプラーを用いた空気サンプルの採取
    1. サンプリング頻度とサンプリング場所を定義することにより、研究目的に応じてサンプリング戦略を選択します。
    2. エアサンプラーの流量を設定します(ここでは、50 L / minで30分間)。流速が200L/minを超えるとウイルスRNAが分解される可能性があるため、流速は200L/min未満の使用を推奨します。
    3. エアサンプラーに滅菌コーンを入れてから、スタートをパルスして収集を開始します。サンプリングが終了したら、5〜15 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)をコーンに加えます。サンプルを手で15秒間静かにボルテックスまたは振とうします。サンプルはクライオチューブで4°Cまたは-80°Cで最大24時間保管できます。
    4. オプションの濃縮ステップを実行できます。漂白剤を使用して、各実験後にコーンを洗浄および除染します。
    5. 市販のキットまたは社内の方法を使用してRNAを抽出します。この研究のサンプルには、溶出量が 50 μL のウイルス RNA 抽出用の特定の市販キットを使用します。
    6. 抽出したRNAの濃度を蛍光RNA定量キットで測定します。抽出したRNAをアリコートに分割し、さらに分析するまで-80°Cで凍結します。
      注:各 RNA 単離手順セットには、抽出中のコンタミネーションの可能性を検出するためのバッファーのみを含むネガティブコントロール(NCI)を含める必要があります。

2. リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)によるSARS-CoV-2 RNAの定量

注:以下のプロトコルは、CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) RT-PCR 診断パネル37 に準拠しています。プライマー/プローブミックスをいくつかのアリコートに分けて、凍結と融解のサイクルを回避します。

  1. 各ターゲット(メンゴウイルス;SARS-CoV-2 [N1 および N2 遺伝子])を 、試薬セットアップルーム内の清潔なフードに入れます。プライマー/プローブミックスと酵素を5回反転させて混合します。あるいは、プライマー/プローブミックスと酵素を光パルスボルテックス5回します。
    注:調製および使用中は、すべての試薬を冷たく保ってください。凍結融解サイクルを最小限に抑えるために、アリコートで凍結することを強くお勧めします。
  2. チューブを回転させて(1,000 x g で15〜30秒間)、底に内容物を集め、チューブをコールドラックまたは氷の上に置きます。
  3. 各ターゲットに1.5 mLの微量遠心チューブを標識します。各微量遠心チューブに、必要な各試薬の量(反応あたりの容量に、必要なコントロールを含む反応回数を掛けたもの)を加えます。ピペッティングで上下に混合し、5秒間遠心分離して内容物を底に集めます。
  4. 微量遠心チューブをコールドラックに保管し、15 μLをストリップPCRチューブまたは冷却ラックの96ウェルプレートに分注します。プレートに蓋をして、核酸処理エリアに移動します(冷却ラックに保管してください)。
  5. 抽出したRNAのアリコートを解凍し、5秒間静かにボルテックスします。5 μL の RNA(5 μL の非テンプレートコントロール [NTC]、ネガティブコントロール オブアイジョン [NCI]、およびポジティブコントロール [PC]に加えて) を、事前に調製したマスターミックスを含む各反応ウェルまたはチューブにピペットで移します。二次汚染を避けるために、必要に応じて手袋を頻繁に交換してください。
  6. 反応プレートまたはチューブ全体を覆い、静かにボルテックスします。プレートまたはPCRチューブを遠心分離(1,000 x g で15〜30秒)します。
  7. 25 μL の RT-qPCR を以下のサイクリング条件で開始します:逆転写酵素を 45 °C で 10 分間。95°Cで10分間のポリメラーゼ活性化;95°Cで15秒間の45サイクルの変性。60°Cで45秒間焼きなまし/伸長します。
  8. Conte et al.38 によって報告されたメンゴウイルス対照の回収効率を計算します。
    Equation 1 × 100

3. 廃水におけるシーケンシングバリアントとデータ解析

注:記載されているプロトコルは、Quickらによって作成された修正プロトコルです39,40。PCRタイリング法によるSARS-CoV-2ゲノム増幅には、ARTICプライマーとVarSkipプライマーの2セットのプライマーを使用します。プライマーの組み合わせは、最良のゲノムカバレッジを保証し、1つのタイプのプライマーが失敗する原因となる新しい突然変異の可能性を最小限に抑えるために使用されます。一般に、プロトコルは逆転写(RT)とアンプリコン生成、配列ライブラリ調製、配列決定とデータ解析の3つの部分に分かれています。

  1. 逆転写とアンプリコンの生成
    1. インプットサンプルをPCRグレードの水で正しく希釈するために、既知のqPCRサイクリング閾値(Ct)があることを確認してください。Ct値は、qPCRによる定量中に得られます。希釈は次の通りです:Ct値が12-15の場合、サンプルを1:100に希釈します。Ct値が15〜18の場合、サンプルを1:10に希釈します。Ct値が18〜35の場合は、サンプルを希釈しないでください。Ct 値が 35 を超えるサンプルは、機能しない可能性が高くなります。
    2. PCRプレートで、各サンプル16 μLをプレート上の所定の位置にピペットで移動します。逆転写(RT)マスターミックス(5x)4 μLを加えます。プレートを覆い、25°Cで2分間、55°Cで20分間、95°Cで1分間の条件でPCR反応を開始します。
    3. 各プライマーセット(ARTICプールAとプールB、VarSkipプールAとプールB)の希釈液を10 μM調製します。 表2のように、プライマーの各セット(ARTICセットAおよびB、およびVarSkipセットAおよびB)のマスターミックスを調製します。これにより、4つのマスターミックスが生まれます。
    4. 新しいPCRプレート上で、20 μLのマスターミックスを対応する各ウェルにピペットで移します。各ミックスに 5 μL の RT サンプルを添加します。
      注:各サンプルには、ARTICプールAとB、VarSkipプールAとBの4つの反応混合物があります。
    5. プレートを覆い、次のようにPCR反応を開始します:98°Cで30秒間ポリメラーゼ活性化。98°Cで15秒間、35サイクルの変性。65°Cで4分間アニーリング/伸長。プレートをスピンダウン(1,000 x g 、15〜30秒)します。ARTI反応プールを結合し、VarSkip反応プールを個別に結合します。各サンプルには、50 μL のアンプリコン反応が 2 回あります。
    6. PCR精製用のビーズベースの試薬50μLを各ウェルに加え、ピペッティングでよく混合します。室温で5分間インキュベートします。
      注:毎回使用する前に、PCR精製試薬を激しく混合してビーズを再懸濁してください。
    7. プレートを磁気分離スタンドに置き、ビーズがペレットを形成し、液体が透明になるのを待ちます(~5分)。上清をピペットで移し、廃棄します。PCRプレートをマグネットスタンドに置いておきます。
    8. PCRプレートをマグネットスタンドに取り付けたまま、ビーズペレットに触れずに各サンプルに200μLの80%エタノールを加えます。エタノールを取り除きます。
    9. 前の手順を繰り返します。磁気スタンドのプレートを30秒間覆わずに放置して、エタノールを蒸発させます。
    10. プレートをマグネットスタンドから取り外し、各サンプルに15 μLのPCRグレードの水を加えます。ピペッティングによりペレットを再懸濁します。室温で2分間インキュベートします。
    11. プレートをマグネットスタンドに戻し、ビーズをペレット化します(2分間)。各サンプルの上清15μLを新しいPCRプレートに慎重にピペットで移します。
    12. 蛍光 RNA 定量キットで各サンプルの濃度を測定します。各サンプルを約 50 ng の 12.5 μL で次のステップに取り込みます。必要に応じて、サンプルをPCRグレードの水で希釈します。
  2. ライブラリの準備
    1. Illumina DNAライブラリ調製キットの反応バッファー1.75 μLと酵素ミックス0.75 μLを各サンプルに加えます。プレートを覆い、短時間ボルテックスし、スピンダウンします(1,000 x g で15〜30秒)。21°Cで5分間、65°Cで5分間インキュベートします。
    2. 新しいプレートで、各サンプルに3 μLのPCRグレードの水を新しいPCRプレートにピペットで移します。調製したサンプル 0.75 μL、シーケンシングライブラリ調製用のバーコード 1.25 μL、および T4 DNA リガーゼマスターミックス 5 μL を加えます。ピペッティングでよく混合し、遠心分離機で短時間スピンダウン(1,000 x g で15〜30秒)し、21°Cで20分間、65°Cで10分間インキュベートします。
      注:使用するサンプルが 25 個未満の場合は、このステップのすべての容量を 2 倍にします。
    3. 各サンプル10 μLを同じ低結合チューブに添加して、すべてのサンプルをまとめてプールします。480 μLを次のステップに進めます。
    4. PCR精製用のビーズベースの試薬192 μLをプールに加え、ピペッティングでよく混合します。室温で10分間インキュベートします。
    5. チューブを磁気スタンドに置き、上澄みがきれいになり、ビーズペレットが形成されるのを待ちます。上澄みを取り除きます。マグネットスタンドからチューブを取り外します。
    6. 700 μL のショートフラグメントバッファー(SFB)を加え、ピペッティングで混合します。マグネットスタンドに戻し、ペレットが形成され、液体が透明になるのを待ちます(~5分)。上清をピペットで取り出し、廃棄します。
    7. 前の手順を繰り返します。チューブを磁気スタンドに置いたままにします。ビーズに触れずに80%エタノール100μLを加えます。エタノールをピペットで取り出し、ビーズを30秒間乾燥させます。
      注意: ビードを過度に乾燥させないでください。
    8. マグネットスタンドからチューブを取り外し、35 μLのPCRグレードの水を加えます。ピペッティングで混合し、室温で2分間インキュベートします。チューブをマグネットスタンドに置き、ビーズがペレットになり、液体が透明になるまで待ちます。上清35μLを新しいチューブにピペットで移します。
    9. プールされたライブラリのRNA濃度を測定します。30〜50 ngのRNAの量に達するのに必要な容量をピペットで固定し、PCRグレードの水で満たして、最終容量の30 μLに到達します。
    10. アダプターライゲーション反応ミックスを調製します:プールライブラリー30 μL、アダプターミックスII5 μL、ライゲーション反応バッファー(5x)10 μL、T4 DNAリガーゼ5 μL。ピペッティングとスピンダウン(1,000 x g で15〜30秒)で混合します。室温で10分間インキュベートします。
    11. PCR精製用のビーズベースの試薬を20 μL添加し、ピペッティングで混合します。室温で10分間インキュベートします。
    12. チューブを磁気スタンドに置き、ビーズペレットが形成され、上清が無色になるのを待ちます。上清を慎重にピペットで取り出し、廃棄します。
    13. マグネットスタンドから取り外し、SFBを125μL添加します。ピペッティングで混合し、磁気スタンドに戻し、ビーズを分離します。液体が透明になったら、ピペットで移し、上清を捨てます。
    14. 前の手順を繰り返します。残った液体の一部が蒸発するまで、磁気スタンドでチューブを30秒間開いたままにします。
    15. 磁気スタンドからチューブを取り外し、15 μLの溶出バッファーを添加します。ピペッティングでよく混合し、短時間スピンダウンします(1,000 x g で15〜30秒)。室温で5分間インキュベートします。マグネットスタンドに2分間置きます。
    16. 上清15μLを新しい低結合チューブにピペットで移します。これが最終的なライブラリです。蛍光DNA定量キットで濃度を測定します。
      注:次のステップでは、12 μLが必要です。濃度が非常に高く、必要なライブラリが 12 μL 未満の場合は、最大 12 μL を溶出バッファー試薬で満たしてください。
  3. フローセルのローディングとシーケンシング
    1. フローセル(R9.4.1)をリアルタイムDNA/RNAシーケンシングデバイスに挿入します。
    2. フラッシュバッファー(FB)試薬のチューブに30 μLのフラッシュテザー(FLT)試薬を添加して、プライミングミックスを調製します。混合してスピンダウンするボルテックス(1,000〜15秒間30 x g )。
    3. プライミングポートカバーを開きます。1,000 μLのピペットを使用して、200 μLに設定し、チップをプライミングポートに挿入します。音量設定ホイールを回し、先端の液体が見えるまで音量を上げます。チップを捨てます。
      注意: チップに数μLの液体が見えるまで、ホイールを回してください。大量に引き抜くと、フローセルが損傷する可能性があります。
    4. 800μLのプライミングミックスをプライミングポートにゆっくりと加え、気泡が発生しないように注意します。5分待ちます。
    5. それまでの間、ライブラリをロードする準備をします。シーケンシングバッファー 37.5 μL、ローディングバッファー 25.5 μL、ライブラリー 12 μL を混合します。
      注:ピペッティングする前に、ローディングバッファーを混合してください。この試薬中のビーズは非常に迅速に沈降します。
    6. ポートカバーを開けます。200 μLのプライミングミックスをプライミングポートにピペットで移します。
      注:カバーポートを開いた状態でプライミングポートにピペッティングすると、サンプルポートから小さな液滴が滴り落ちることがあります。ピペットは、サンプルポートが液滴をこぼさずに引き込めるように、十分にゆっくりと行います。
    7. 調製したライブラリーをロードする前に、ピペッティングでよく混合します。75 μLに設定した100 μLのピペットを使用して、ライブラリとピペットをサンプルポートに一滴ずつ取り込みます。液体のオーバーフローを防ぐために、ポートに触れず、各滴がポートに吸収されるのを待ってから次の滴をロードしてください。
    8. カバーポートとプライミングポートを閉じます。ソフトウェアを開き、シーケンシング実験を開始します。[ベースコール オン] を選択します。96のマルチプレックスサンプルを含むライブラリの場合、通常、10〜12時間のシーケンシングで十分なデータが得られます。
      注:ソフトウェアを使用して、サンプルシートを.csv形式で挿入できます。サンプルシートには、flow_cell_id、position_id、sample_id、experiment_id、flow_cell_product_code、キットのデータが必要です。フローセルID(フローセルの側面に記載)は、使用するキットとともに必要です。推奨されるプロトコルについては、LSK109キットを選択する必要があります。
  4. シーケンシングデータ解析
    1. 圧縮されたfastq読み取りをwf-aticワークフロー41に挿入する。2 つの異なるプライマースキーム(ARTIC/V4.1 と NEB-VarSkip/v1a)を使用してワークフローを個別に実行します。2つの"。primertrimmed.rg.sorted.bam」ファイルがサンプルごとに作成されます。
    2. 「samtools merge」コマンド42を使用して、BAMファイルを1つのファイルにマージします。マージされたBAMファイルをFreyjaツールに挿入し、デフォルト設定のままにして、相対的な系統の豊富さを回復します43。
    3. FASTAファイルを作成するには、マージされたBAMファイルをデフォルト設定44,45で「samtools mpileup」および「ivar」ツールに挿入します。変異呼び出しの場合は、FASTAファイルをNextcladeツール46,47にロードします。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

表 3 にまとめた結果は、本稿で説明した方法を用いた廃水および空気サンプル中の SARS-CoV-2 RNA の検出および定量の例を示しています。廃水サンプルはスペインとスロベニアの廃水処理施設から収集され、3 回の反復のうち少なくとも 2 回で Ct が 40 未満の場合は陽性と見なされ、Ct の変動が 5% 未満の場合は定量が有効と見なされました。スペインとポルトガルでは、屋内と屋外の空気サンプルが収集され、同じルールが適用されました。この研究の目的はSARS-CoV-2 RNAの検出であり、定量化ではなかったため、廃水サンプルのトリプリケートではなく、空気サンプルに重複が使用されました。さらに、RT-qPCRの実行は、(このプロトコルで説明されているように)使用したすべてのコントロールが期待どおりに動作し、メンゴウイルスRNAコントロールで有意な逸脱が観察されなかった場合にのみ有効と見なされました。これらのサンプルでは、メンゴウイルスの回収効率は13.7%から19.7%の間で変化しました。抽出した RNA を 10 倍および 100 倍に希釈し、得られた RT-qPCR の結果を比較し、市販のキットを使用して阻害を評価しました。各阻害コントロールキットの指示は、メーカーの説明に従ってください。.

廃水サンプルの標準偏差は1.91%から13.98%で、3.05 x 103から2.83 x 108遺伝子コピー/Lの範囲でした。これは、以前の研究6,48,49,50と一致しています。

このプロトコルに記載されているように、サンプルを配列決定し、3つの配列決定されたサンプル結果の例を 表4 および 図1に要約します。3つのサンプルすべてにおいて、系統BA.5.xはFreyjaツールによって最も普及しているものとして割り当てられました(95.3%、95.4%、99.8%)。

Figure 1
図1:選択された廃水サンプルにおけるSARS-CoV-2系統の有病率。 系統は Freyja ツールを使用して割り当てられました。有病率の要約は、一部のデータの質が十分ではないため、必ずしも100%に達するとは限りません。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

表 1:RT-qPCR による SARS-CoV2 定量用のマスターミックスを調製するために添加する試薬と容量。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:サンプル中のSARS-CoV-2ゲノム全体を増幅するためのマスターミックスを調製するために、それぞれ添加する試薬と容量。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表3:廃水および空気サンプルからのSARS-CoV-2 RNAのRT-qPCR定量結果の要約。 N1遺伝子は定量に使用され、N2は確認(陽性または陰性)に使用されました。結果はコピー数/Lで表されます。 この 表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表4:検出された変異と系統の有病率。系統は、Freyjaツールを使用して、Nextcladeを使用して見つかった目的の変異に従って割り当てられました。 各サンプルのゲノムカバレッジが表示されます。有病率の要約は、一部のデータの質が十分ではないため、必ずしも100%に達するとは限りません。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

(RT-)qPCR法を用いた微生物およびウイルスの検出および定量は、その優れた感度により広く受け入れられています。しかし、これらの手法は、環境サンプルを分析する際に多くの課題に直面します。廃水サンプルには、測定値を歪めたり、誤解を招く結果を生成したりする可能性のある阻害物質が豊富に含まれています。これらの制限に取り組み、精度を高めるために、複雑なプロトコルが考案、設計、実装されました。このプロトコルは、科学文献のプロトコルを組み合わせて調整され、プロセスの各段階で一連の厳格な管理を組み込むことにより、qPCR法に固有の制限に特化して対処します。これらの厳格な品質管理手段を統合することにより、このプロトコルは、複雑な環境サンプル中のqPCRベースの検出および定量法が直面する課題に対する堅牢なソリューションを提供します51,52。ネガティブコントロール(NCI)およびノンテンプレートコントロール(NTC)は、RNA抽出およびRT-qPCR反応中のコンタミネーションの可能性を評価するために不可欠なツールです。さらに、メンゴウイルスコントロールRNAの組み込みは、サンプル間のばらつき、濃縮ステップの効率、複雑な環境サンプル中に存在する薬剤の阻害効果を評価するための重要な手段となります。すべてのRT-qPCR反応において、増幅プロセスの有効性を確認するためにポジティブコントロールを含める必要があります。サンプルの保管時間や処理時間など、プロトコルの各ステップを注意深く監視することが重要です。サンプルの劣化は、温度や廃水の複雑な組成によって影響を受ける可能性があるため、サンプルを4°Cの温度で保存し、24時間以内に処理することが不可欠です。これらの厳格な品質管理措置を遵守することにより、研究者や公衆衛生従事者は、環境サンプルを自信を持って正確に分析し、微生物やウイルスの集団に関する重要な洞察を明らかにし、環境要因が人間の健康に与える影響をよりよく理解することができます48。

SARS-CoV-2検出用のRNAターゲットの選択は、RT-qPCRアッセイの感度に影響を与える重要な要素です。この研究では、著者らはRdRp、E、N1、およびN2ターゲットを評価し、RdRpおよびEアッセイはN1およびN2アッセイよりも感度が低いことを発見し、以前の研究と一致した53。N1およびN2アッセイはダブルクエンチャープローブを使用しており、(RT-)qPCRアッセイで感度を高めることが示されている54。これらの理由から、非常に低濃度が見つかった場合の疑問を排除するために、定量にN1を使用し、RNAの存在の確認にN2を使用することが決定されました。RT-qPCRターゲット間で観察された不一致は、以前に報告されています36。

いくつかの研究が同様のプロトコルを採用しており、進行中のCOVID-19パンデミック中に廃水中のSARS-CoV-2 RNAの検出と定量に成功したことが報告されています6,48,49,55,56。報告されたSARS-CoV-2 RNA濃度は、この研究およびプロトコル48,50,55で報告された濃度と一致しています。これらの研究のいくつかは、アクティブな症例とRT-qPCR標的遺伝子、特にN1およびN2の濃度との関係を調査しています6,36,49,50,55,57,58,59。得られた遺伝子濃度のばらつきを小さくするために、実験濃度にサンプリング時の流量を掛けて、初期ウイルス量36を得ることが提案されている。このアプローチは、スペインのVATar COVID-19プロジェクト(廃水中のCOVID-19の国家モニタリングシステム)に組み込まれています60。

COVID-19廃水ベースの疫学(WBE)研究の次の段階として、研究者は廃水中のSARS-CoV-2変異を検出して、コミュニティ内で懸念される変異株の循環を推定しようとしました。これまでの研究では、廃水中で特定された変異体と、同時に集団に存在する変異体との間に強い相関関係があることが示されています。これらの知見は、廃水ベースのモニタリングがSARS-CoV-2変異株の拡散を追跡するための貴重なツールとして役立つ可能性があることを示唆している61,62。WBEはSARS-CoV-2のモニタリングに大きな期待が寄せられており、パンデミックに対する将来のサーベイランス戦略の開発に活用することができます。このアプローチは、個々の検査が限られており、多くの症例が無症状である可能性があるパンデミックの初期段階で特に有用であり、臨床サーベイランスを補完する戦略を持っています。したがって、WBEは、他のより高価な監視戦略を買う余裕がない経済的能力が低い場所で特に役立ちます。説明されている方法は、将来監視に関連する可能性のある他のウイルスに簡単に適応できます。

屋内と屋外の環境での空気サンプリングの結果、SARS-CoV-2 RNAは両方の環境に存在することが明らかになりましたが、屋外環境では濃度は低いことが明らかになりました38,63,64。これらの知見は、飲食や音楽祭への参加など、マスク着用やソーシャルディスタンスの維持が困難な活動や曝露が、COVID-19の感染リスクを高める可能性があることを示唆している。このようなリスクを軽減するためには、特にデルタ株(B.1.617.2)やオミクロン株(B.1.1.529)など、感染力の強い新たな変異株の出現に伴い、適切な換気対策とマスクの使用を検討することが重要です。多くの地域でCOVID-19の制限が解除されたことを踏まえ、SARS-CoV-2の市中感染を最小限に抑え、将来の病気の発生を防ぐために、マスクの使用を維持することが推奨されます5,21,26,65。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者は、競合する経済的利害関係やその他の利益相反を持っていません。

Acknowledgments

この作業は、カスティーリャ・イ・レオン州政府とFEDERプログラム(プロジェクトCLU 2017-09、UIC315、VA266P20)からの資金援助を受けて実施されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(cover-2019)-and-the-virus-that-causes-it (2020).
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/lab-safety-practices.html (2020).
  3. Gonçalves, J., et al. Centralized and decentralized wastewater-based epidemiology to infer COVID-19 transmission - A brief review. One Health. 15, 100405 (2022).
  4. Dawood, F. S., et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 12 (9), 687-695 (2012).
  5. Gonçalves, J., Koritnik, T., Paragi, M. Assessment of weather and atmospheric pollution as a co-factor in the spread of SARS-CoV-2. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 92 (3), e2021094 (2021).
  6. Gonçalves, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in hospital wastewater from a low COVID-19 disease prevalence area. The Science of The Total Environment. 755, 143226 (2021).
  7. Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G. Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance. 25 (10), 2000180 (2020).
  8. Polo, D., et al. Making waves: Wastewater-based epidemiology for COVID-19 - approaches and challenges for surveillance and prediction. Water Research. 186, 116404 (2020).
  9. Shmueli, G., Burkom, H. Statistical challenges facing early outbreak detection in biosurveillance. Technometrics. 52 (1), 39-51 (2010).
  10. Simonsen, L., et al. Global mortality estimates for the 2009 influenza pandemic from the GLaMOR project: A modeling study. PLoS Medicine. 10 (11), e1001558 (2013).
  11. Oran, D. P., Topol, E. J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative reivew. Annals of Internal Medicine. 173, 362-367 (2020).
  12. Daughton, C., Jones-Lepp, T. Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. ACS Symposium Series. , American Chemical Society. Washington, DC. (2001).
  13. Zuccato, E., et al. Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse. Environmental Health. 4, 14 (2005).
  14. Aguiar-Oliveira, M. deL., et al. Wastewater-based epidemiology (WBE) and viral detection in polluted surface water: A valuable tool for COVID-19 surveillance-a brief review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 9251 (2020).
  15. García-Encina, P. A. Wastewater-based epidemiology (WBE). Water and Environment Journal. 35 (4), 1162-1163 (2021).
  16. Mao, K., Zhang, H., Pan, Y., Yang, Z. Biosensors for wastewater-based epidemiology for monitoring public health. Water Research. 191, 116787 (2021).
  17. Shereen, M. A., Khan, S., Kazmi, A., Bashir, N., Siddique, R. COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 24, 91-98 (2020).
  18. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800 (2020).
  19. Lei, H., et al. SARS-CoV-2 environmental contamination associated with persistently infected COVID-19 patients. Influenza and Other Respiratory Viruses. 14 (6), 688-699 (2020).
  20. Razzini, K., et al. SARS-CoV-2 RNA detection in the air and on surfaces in the COVID-19 ward of a hospital in Milan, Italy. The Science of The Total Environment. 742, 140540 (2020).
  21. da Silva, P. G., Gonçalves, J., Nascimento, M. S. J., Sousa, S. I. V., Mesquita, J. R. Detection of SARS-CoV-2 in the indoor and outdoor areas of urban public transport systems of three major cities of Portugal in 2021. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5955 (2022).
  22. Barbieri, P., et al. Molecular detection of SARS-CoV-2 from indoor air samples in environmental monitoring needs adequate temporal coverage and infectivity assessment. Environmental Research. 198, 111200 (2021).
  23. Lednicky, J., et al. Earliest detection to date of SARS-CoV-2 in Florida: Identification together with influenza virus on the main entry door of a university building, February 2020. PLoS One. 16 (1), 0245352 (2021).
  24. Santarpia, J. L., et al. Aerosol and surface contamination of SARS-CoV-2 observed in quarantine and isolation care. Scientific Reports. 10 (1), 12732 (2020).
  25. Chirizzi, D., et al. SARS-CoV-2 concentrations and virus-laden aerosol size distributions in outdoor air in north and south of Italy. Environment International. 146, 106255 (2021).
  26. Hadei, M., et al. Presence of SARS-CoV-2 in the air of public places and transportation. Atmospheric Pollution Research. 12 (3), 302-306 (2021).
  27. Moreno, T., et al. Tracing surface and airborne SARS-CoV-2 RNA inside public buses and subway trains. Environment International. 147, 106326 (2021).
  28. Mouchtouri, V. A., et al. Environmental contamination of SARS-CoV-2 on surfaces, air-conditioner and ventilation systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 230, 113599 (2020).
  29. Setti, L., et al. Airborne transmission route of COVID-19: why 2 meters/6 feet of inter-personal distance could not be enough. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 2932 (2020).
  30. SARS-CoV-2 Transmission. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html (2021).
  31. Coronavirus Disease (COVID-19): How is it Transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2021).
  32. Dinoi, A., et al. A review on measurements of SARS-CoV-2 genetic material in air in outdoor and indoor environments: Implication for airborne transmission. The Science of the Total Environment. 809, 151137 (2022).
  33. Bosch, A., et al. Analytical methods for virus detection in water and food. Food Analytical Methods. 4, 4-12 (2011).
  34. Gonçalves, J., et al. Surveillance of human enteric viruses in coastal waters using concentration with methacrylate monolithic supports prior to detection by RT-qPCR. Marine Pollution Bulletin. 128, 307-317 (2018).
  35. La Rosa, G., Muscillo, M. Molecular detection of viruses in water and sewage. Viruses in Food and Water. , Woodhead Publishing. 97-125 (2013).
  36. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  37. CDC - 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Fact Sheet for Healthcare Providers. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/85028 (2020).
  38. Conte, M. Airborne concentrations of SARS-CoV-2 in indoor community environments in Italy. Environmental Science and Pollution Research International. 29 (10), 13905-13916 (2022).
  39. Quick, J. nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost). protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye (2020).
  40. Tyson, J. R. Improvements to the ARTIC multiplex PCR method for SARS-CoV-2 genome sequencing using nanopore. , (2020).
  41. ARTIC SARS-CoV-2 Workflow. , Available from: https://github.com/epi2me-labs/wf-artic (2022).
  42. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. Freyja. , Available from: https://github.com/andersen-lab/Freyja (2022).
  44. Li, H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatics. 27 (21), 2987-2993 (2011).
  45. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).
  46. Hadfield, J., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics. 34 (23), 4121-4123 (2018).
  47. Aksamentov, I., Roemer, C., Hodcroft, E. B., Neher, R. A. Nextclade: clade assignment, mutation calling and quality control for viral genomes. Journal of Open Source Software. 6 (67), 3773 (2021).
  48. Markt, R., et al. Detection and stability of SARS-CoV-2 fragments in wastewater: impact of storage temperature. Pathogens. 10 (9), 1215 (2021).
  49. Kocamemi, B. A., et al. First Data-Set on SARS-CoV-2 Detection for Istanbul Wastewaters in Turkey. MedRxiv. , (2020).
  50. Randazzo, W., et al. SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research. 181, 115942 (2020).
  51. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  52. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Shay Fout, G. Development of homologous viral internal controls for use in RT-PCR assays of waterborne enteric viruses. Journal of Virological Methods. 121, 39-48 (2004).
  53. Nalla, A. K. Comparative performance of SARS-CoV-2 detection assays using seven different primer-probe sets and one assay kit. Journal of Clinical Microbiology. 58 (6), 00557 (2020).
  54. Hirotsu, Y., Mochizuki, H., Omata, M. Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Journal of Virological Methods. 284, 113926 (2020).
  55. Ahmed, W. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of The Total Environment. 728, 138764 (2020).
  56. Bar-Or, I., et al. Detection of SARS-CoV-2 variants by genomic analysis of wastewater samples in Israel. The Science of the Total Environment. 789, 148002 (2021).
  57. La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E. Coronavirus in water environments: Occurrence, persistence and concentration methods - A scoping review. Water Research. 179, 115899 (2020).
  58. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases. mSystems. 5, 00614 (2020).
  59. Wurtzer, S., et al. Evaluation of lockdown effect on SARS-CoV-2 dynamics through viral genome quantification in waste water, Greater Paris, France, 5 March to 23 April 2020. European Communicable Disease Bulletin. 25 (50), 2000776 (2020).
  60. VATar COVID-19 | Caso de Exito - Ministerio para la Transición Ecologica y el Reto Demografico. , Available from: https://esri.es/es-es/descubre-los-gis/casos-de-exito/administracion-/vatar-covod19-miteco-cs (2022).
  61. Nemudryi, A., et al. Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater. Cell Reports. Medicine. 1 (6), 100098 (2020).
  62. Rios, G., et al. Monitoring SARS-CoV-2 variants alterations in Nice neighborhoods by wastewater nanopore sequencing. The Lancet Regional Health. Europe. 10, 100202 (2021).
  63. Gomes da Silva, P. Environmental dissemination of SARS-CoV-2 in a University Hospital during the COVID-19 5th wave Delta variant peak in Castile-León, Spain. International Journal of Environmental Research and Public Health. 20, 1574 (2023).
  64. Gonçalves, J., et al. Exposure assessment of SARS-CoV-2 and Nov GII/GII in aerosols generated by a municipal wastewater treatment plant. , (2022).
  65. Lednicky, J. A., et al. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. International Journal of Infectious Diseases. 108, 212-216 (2021).

Tags

Environmental Sciences SARS-CoV-2 RNA RT-qPCR シーケンシング 懸念される変異株
廃水および大気サンプル中のSARS-CoV-2 RNAの定量と全ゲノム特性評価
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonçalves, J., Gomes da Silva,… More

Gonçalves, J., Gomes da Silva, P., Koritnik, T., Bosilj, M., Torres-Franco, A., Diaz, I., Rodriguéz, E., Marcos, E., Mesquita, J. R., García-Encina, P. Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples. J. Vis. Exp. (196), e65053, doi:10.3791/65053 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter