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Concentration de particules virales provenant d’échantillons d’eau et d’eaux usées prélevés dans l’environnement par floculation et ultrafiltration du lait écrémé

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65058
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2
1Department of Civil Engineering, Price Faculty of Engineering, University of Manitoba, 2Department of Microbiology, Faculty of Science, University of Manitoba

Summary

La concentration de virus à partir d’échantillons d’eau et d’eaux usées dans l’environnement est une tâche difficile, effectuée principalement pour l’identification et la quantification des virus. Bien que plusieurs méthodes de concentration virale aient été développées et testées, nous démontrons ici l’efficacité de l’ultrafiltration et de la floculation du lait écrémé pour les virus à ARN avec différents types d’échantillons.

Abstract

L’épidémiologie basée sur l’eau et les eaux usées est apparue comme des méthodes alternatives pour surveiller et prédire l’évolution des épidémies dans les communautés. La récupération des fractions microbiennes, y compris les virus, les bactéries et les microeucaryotes à partir d’échantillons d’eaux usées et d’eau environnementale est l’une des étapes difficiles de ces approches. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur l’efficacité de récupération de l’ultrafiltration séquentielle et des méthodes de floculation de lait écrémé (SMF) utilisant l’ARN blindé comme virus test, qui est également utilisé comme contrôle par d’autres études. Une préfiltration avec des filtres à disque à membrane de 0,45 μm et 0,2 μm a été appliquée pour éliminer les particules solides avant l’ultrafiltration afin d’éviter le colmatage des dispositifs d’ultrafiltration. Les échantillons d’essai, traités avec la méthode d’ultrafiltration séquentielle, ont été centrifugés à deux vitesses différentes. Une vitesse accrue a entraîné une baisse des taux de récupération et de positivité de l’ARN blindé. D’autre part, SMF a entraîné des taux de récupération et de positivité relativement constants de l’ARN blindé. Des tests supplémentaires effectués avec des échantillons d’eau environnementale ont démontré l’utilité de SMF pour concentrer d’autres fractions microbiennes. La répartition des virus en particules solides pourrait avoir un impact sur les taux de récupération globaux, compte tenu de l’étape de préfiltration appliquée avant l’ultrafiltration des échantillons d’eaux usées. SMF avec préfiltration a donné de meilleurs résultats lorsqu’il est appliqué à des échantillons d’eau environnementale en raison de concentrations solides plus faibles dans les échantillons et donc de taux de séparation plus faibles dans les solides. Dans la présente étude, l’idée d’utiliser une méthode d’ultrafiltration séquentielle est née de la nécessité de diminuer le volume final des concentrés viraux pendant la pandémie de COVID-19, lorsque l’approvisionnement en dispositifs d’ultrafiltration couramment utilisés était limité et qu’il était nécessaire de développer d’autres méthodes de concentration virale.

Introduction

La détermination de la concentration effective de microorganismes dans les échantillons de surface et d’eaux usées pour l’analyse des communautés microbiennes et les études épidémiologiques est l’une des étapes importantes pour surveiller et prévoir l’évolution des éclosions dans les communautés 1,2. La pandémie de COVID-19 a révélé l’importance d’améliorer les méthodes de concentration. La COVID-19 est apparue à la fin de 2019 et, en mars 2023, constitue toujours une menace pour la santé humaine, la vie sociale et l’économie. Les stratégies efficaces de surveillance et de contrôle visant à atténuer les répercussions des éclosions de COVID-19 dans les communautés sont devenues un sujet de recherche important, car de nouvelles vagues et variantes de la COVID-19 ont fait leur apparition en plus de la transmission et de la propagation rapides du virus, ainsi que des cas asymptomatiques non déclarés et non diagnostiqués 3,4,5. L’utilisation de l’épidémiologie basée sur les eaux usées pour la COVID-19 par les organisations de la société civile, les agences gouvernementales et les services publics ou privés a été utile pour fournir rapidement des informations liées à l’épidémie et atténuer les impacts des épidémies de COVID-19 6,7,8,9. Cependant, la concentration de SARS-CoV-2, un virus à ARN enveloppé, dans les échantillons d’eaux usées pose toujours des défis10. Par exemple, l’un de ces défis est la répartition du SRAS-CoV-2 dans les solides d’eaux usées, ce qui peut avoir une incidence sur la récupération lorsque les solides sont éliminés pendant la concentration11. Si tel est le cas, la quantification/évaluation devrait être axée sur les phases solide et aqueuse des échantillons d’eau environnementale, plutôt que sur la phase aqueuse seulement. En outre, le choix de la méthode de concentration peut être modifié en fonction des essais et des analyses en aval. La concentration de particules virales et d’agents pathogènes provenant d’échantillons environnementaux est devenue un sujet de recherche urgent avec les développements dans les domaines du séquençage et du microbiome.

Diverses méthodes de concentration virale ont été appliquées dans le domaine de la concentration virale à partir d’échantillons d’eau et d’eaux usées environnementales. Certaines méthodes couramment utilisées sont la filtration, la floculation de lait écrémé (SMF), l’adsorption/élution et la précipitation du polyéthylèneglycol12-17. Parmi eux, le SMF a été considéré comme une méthode peu coûteuse et efficace, testée avec succès et appliquée pour récupérer des virus, y compris le SARS-CoV-2, des eaux usées et des eaux de surface12,15,16,18. La procédure SMF est une approche relativement nouvelle qui est de plus en plus reconnue par de nombreuses études environnementales comme une méthodologie appropriée pour récupérer simultanément un large éventail de micro-organismes tels que des virus, des bactéries et des protozoaires à partir de tous les types d’échantillons d’eau, à savoir les échantillons de boues, d’eaux usées brutes, d’eaux usées et d’effluents19. Comparativement à d’autres méthodes connues de récupération de virus à partir d’échantillons environnementaux, comme l’ultrafiltration et l’élution glycine-alcaline, l’approche basée sur la lyophilisation ou l’ultracentrifugation et l’élution glycine-alcaline, la FMS a été signalée comme la méthode la plus efficace avec des taux de récupération et de détection virale plus élevés18,20. Dans la présente étude, nous avons utilisé l’ARN blindé comme virus test pour évaluer l’efficacité de récupération des méthodes de concentration virale, y compris les tests pour évaluer la récupération du SARS-CoV-221,22.

Ici, nous avons testé des échantillons d’eaux usées et d’eau environnementale pour démontrer l’utilité de la SMF et d’une méthode d’ultrafiltration séquentielle pour concentrer les fractions microbiennes pour la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR), la métagénomique basée sur les séquences et le séquençage à amplicon profond. La SMF est une méthode relativement moins chère et optimale pour un plus grand volume d’échantillons par rapport aux méthodes d’ultrafiltration. L’idée d’utiliser une méthode d’ultrafiltration séquentielle est née de la nécessité de diminuer le volume final des concentrés viraux pendant la pandémie de COVID-19, lorsque l’approvisionnement en dispositifs d’ultrafiltration couramment utilisés était limité et qu’il était nécessaire de développer d’autres méthodes de concentration virale.

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Protocol

1. Comparaison de l’ultrafiltration en série et de la floculation du lait écrémé avec les virus concentrés dans les échantillons d’eaux usées

  1. Préparation des échantillons
    1. Prélever 2 L d’échantillons composites d’eaux usées brutes (influentes) proportionnels au débit sur 24 h. Des échantillons ont été prélevés dans les trois principales usines de traitement des eaux usées (STEP) de Winnipeg, au Canada, au cours de l’été et de l’automne 2020 (tableau 1).
    2. Transporter les échantillons au laboratoire dans des bouteilles résistantes à la lumière dans une glacière et les traiter dans les 24 heures. Recueillir des données sur les caractéristiques physico-chimiques et biologiques des eaux usées.
  2. Tests de concentration du virus
    NOTE: Une méthode d’ultrafiltration séquentielle et une méthode de floculation organique, à savoir la floculation de lait écrémé (SMF), ont été appliquées pour évaluer l’efficacité totale de récupération de chaque méthode en utilisant l’ARN blindé comme virus d’essai.23. D’autres chercheurs ont également utilisé l’ARN blindé comme virus de contrôle pour évaluer la récupération des méthodes de concentration pour les virus enveloppés, tels que la famille Coronaviridae22,24,25,26.
    1. Pour l’ajout d’ARN blindé, définissez les volumes d’analyse des eaux usées pour les méthodes d’ultrafiltration et de SMF à 140 mL et 500 mL, respectivement. À l’aide d’un pipeteur, piquer 5 x 104 copies d’ARN blindé dans six échantillons d’eaux usées fraîches prélevés à une date et six échantillons d’eaux usées fraîches à une autre date, pour chaque méthode d’ultrafiltration; en outre, six échantillons d’eaux usées stockés (à 4 °C) ont été prélevés à une troisième date ultérieure et traités quelques jours plus tard pour SMF.
      REMARQUE : Chacun des six ensembles d’échantillons prélevés à des dates différentes était composé de deux échantillons provenant de chacune des trois stations d’épuration. Dans notre étude, la première série d’échantillons d’eaux usées fraîches a été recueillie le 8 juillet 2020, la seconde le 30 septembre 2020 et les échantillons d’eaux usées seront stockés pour SMF le 14 octobre 2020.
    2. Remuer pendant 30 min à 4 °C pour inoculer et homogénéiser l’ARN blindé dans les échantillons à l’aide d’un agitateur magnétique.
    3. Retirez toutes les particules ou cellules de plus de 0,2 μm et effectuez l’ultrafiltration.
      1. Filtrer les échantillons d’eaux usées enrichies (120 mL de chaque échantillon enrichi de 140 mL) à travers une étamine et une liaison à faible teneur en protéines, des filtres à disque à membrane de 0,45 μm et 0,2 μm et 47 mm, respectivement, pour éliminer les grosses particules, les sédiments, les eucaryotes et les bactéries27. Traiter les échantillons filtrés en utilisant les méthodes d’ultrafiltration décrites ci-dessous.
        REMARQUE : Les échantillons d’eaux usées prélevés le 8 juillet et le 30septembre ont été utilisés pour des méthodes d’ultrafiltration avec 3 000 xg et 7 500 x g, respectivement.
      2. Pour l’ultrafiltration séquentielle à 3 000 x g (UF-3k x g), concentrer un total de 120 mL de l’échantillon d’essai prélevé à la première date à 3 000 x g pendant 30 minutes en chargeant 60 mL de l’échantillon deux fois à environ 5 mL à l’aide d’un dispositif centrifuge de marque A, 30 kDa. Ensuite, concentrez le volume de 5 mL à 3 000 x g pendant 30 minutes à l’aide d’un dispositif centrifuge de marque B, 30 kDa, à 500-1 200 μL.
      3. Pour l’ultrafiltration séquentielle à 7 500 x g (UF-7,5k x g), modifiez la vitesse de centrifugation du dispositif centrifuge de marque B de 3 000 x g à 7 500 x g pour obtenir des volumes finaux plus petits, conformément aux recommandations du fabricant, et conservez la vitesse de centrifugation du dispositif centrifuge de marque A identique.
        NOTE: Les tests ont été effectués avec les échantillons prélevés le 30septembre.
    4. Pour SMF, effectuez les étapes décrites ci-dessous.
    5. Augmenter les échantillons d’eaux usées (500 mL chacun) pour les concentrer directement en utilisant le protocole SMF16,18, sans préfiltration avec une étamine et des filtres à disque à membrane à faible teneur en protéines, comme décrit ci-dessous.
    6. Dissoudre 0,5 g de lait écrémé en poudre dans 50 mL d’eau de mer synthétique pour obtenir une solution de lait écrémé à 1 % (p/v) et ajuster soigneusement le pH de la solution à 3,5 en utilisant 1 N HCl.
      NOTE: L’acidification fait que les virus s’agrègent et précipitent hors de l’eau en raison du changement de leur point isoélectrique16 et améliore la solubilité du lait en poudre28.
    7. Ajouter 5 mL de solution de lait écrémé à 500 mL d’échantillons d’eaux usées crues pour obtenir une concentration finale de lait écrémé de 0,01 % (p/v).
    8. Remuer les échantillons pendant 8 h à vitesse moyenne et laisser les flocs formés se déposer encore 8 h à température ambiante.
    9. Retirer soigneusement les surnageants à l’aide de pipettes sérologiques sans déranger les flocs déposés. Transférer un volume final de 50 mL contenant les flocs dans des tubes à centrifuger et centrifuger à 8 000 x g pendant 30 min à 8 °C.
    10. Mettez soigneusement les granulés au rebut à l’aide d’une spatule stérilisée et remettez en suspension les granulés restants dans les tubes dans 250 μL de tampon phosphate de sodium 0,2 M (pH 7,5) après le retrait du surnageant. Transférer les pastilles raclées et remises en suspension dans les mêmes tubes minicentrifugeuses de 1,5 mL.
  3. Effectuer l’extraction de l’ARN viral à partir de concentrés viraux d’échantillons d’eaux usées et des tests d’efficacité de récupération à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN avec un rapport de 25:24:1 de phénol:chloroforme:alcool isoamylique et β-mercaptoéthanol, selon les instructions du fabricant, pour améliorer l’efficacité de l’extraction. Enfin, éluer l’ARN dans 50 μL de tampon d’élution.
  4. Analyse quantitative en chaîne par polymérase en temps réel (RT-qPCR)
    1. Quantifier l’ARN blindé en utilisant des dilutions décuplées (7,8 x 104 à 7,8 copies de gènes) d’un ADN simple brin synthétique ou d’une construction gBlock. Voir le tableau 2 pour les amorces et les ensembles de sondes qui détectent et quantifient l’ARN blindé.
    2. Concevoir des ensembles d’amorces et de sondes à l’aide de l’outil de conception d’amorces29 et cibler une région de 95 pb (construction gBlock) dans le génome de l’ARN blindé.
    3. Obtenez des courbes d’étalonnage pour chaque exécution RT-qPCR. Inclure des contrôles négatifs dans chaque qPCR. Exécutez des normes, des exemples et des contrôles sans modèle en trois exemplaires.
    4. Préparer chaque mélange RT-qPCR de 10 μL dans l’ordre suivant : 2,5 μL de mélange maître 4x, 400 nM de chaque apprêt, sonde 200 nM et 2,5 μL de gabarit, ainsi que de l’eau distillée ultrapure sans DNAse/RNAse.
    5. Effectuer des réactions de cyclage thermique à 50 °C pendant 5 min, suivies de 45 cycles de 95 °C pendant 10 s et de 60 °C pendant 30 s sur un système de PCR en temps réel. Si le CT était de <40, considérez l’échantillon d’ARN blindé positif.
    6. Effectuer des tests qPCR et RT-qPCR en utilisant de l’albumine sérique bovine avec des échantillons d’eaux usées brutes afin d’évaluer la possibilité d’inhibiteurs ou de contaminants tels que les acides humiques24. Aucune différence significative n’a été observée entre les échantillons avec et sans l’enzyme.
  5. Calculer les concentrations à partir de la courbe standard. Calculez le pourcentage d’efficacité de récupération en divisant la concentration récupérée par la concentration d’augmentation.
  6. Transformez le nombre de copies de gènes à l’aide de la fonction log10 pour l’analyse. Exécutez un modèle linéaire général à l’aide d’un outil d’analyse statistique sur les données qPCR. Appliquez le test de Tukey pour détecter les différences entre les méthodes et les traitements. Prenez une valeur de p de 0,05 comme niveau de signification minimum pour le test.

2. Filtration et concentration des virus à ADN et à ARN pour l’épidémiologie à base d’eau

  1. Pour la collecte d’eau de surface environnementale, prélever 10 L d’échantillons d’eau de surface environnementale et utiliser 10 L d’échantillons d’eau désionisée pour le contrôle du bruit de fond. Conserver tous les échantillons dans une salle à 4 °C jusqu’à leur traitement dans les 24 heures suivant le prélèvement.
  2. Effectuer la concentration de virus à partir d’échantillons environnementaux avec SMF en suivant les étapes décrites ci-dessous.
    1. Effectuer la filtration par capsule et sous vide à l’aide de capsules d’échantillonnage d’eau souterraine de grande capacité et de filtres à disques à membrane de 0,45 μm, 0,2 μm et 0,1 μm pour minimiser le bruit pendant le séquençage métagénomique, des fractions plus grandes telles que les micro-eucaryotes et les bactéries aux plus petites telles que les virus.
    2. Préparer une solution de lait écrémé préfloculé à 1 % poids par volume dans 1,32 L d’eau de mer synthétique avec 13,2 g de lait écrémé en poudre. Ajuster le pH de cette suspension à 3,5 en utilisant 1 N HCl.
  3. Ajuster le pH des échantillons d’eau de surface environnementale à 3,5 en utilisant 1 N HCl.
  4. Transvaser 100 mL de la solution de lait écrémé acidifié préfloculée dans des échantillons d’eau ambiante acidifiée de 10 L (pH 3,5) (concentration finale de lait écrémé de 0,01 % [p/v]).
  5. À l’aide d’un agitateur magnétique et d’une barre d’agitation magnétique, agiter les échantillons pendant 8 h à température ambiante et laisser les flocs sédimenter par gravité pendant 8 heures supplémentaires. Sans déranger les flocs, retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pompe à vide.
  6. Aliquote et équilibrer les flocs restants en fonction du poids dans des tubes à centrifuger de 50 ml et les faire tourner vers le bas à 8 000 x g pendant 30 minutes à 4 °C.
  7. Jeter le surnageant et dissoudre la pastille résultante (qui contient théoriquement des virus d’intérêt) dans 200 μL de tampon phosphate de sodium 0,2 M.
  8. Traiter la pastille dissoute avec la DNase I et la RNase A, en suivant les instructions du fabricant, afin d’éliminer l’ADN et l’ARN libres présents qui peuvent être coprécipités en raison de la trousse utilisée pour l’extraction des acides nucléiques. Désactivez la DNase I et la RNase A en suivant les instructions du fabricant.
  9. Extraire les acides nucléiques totaux de la pastille dissoute à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN / ARN, conformément aux instructions du fabricant.
  10. Quantifier la quantité totale d’ADN et d’ARN extraits d’échantillons d’effluents à l’aide d’un fluoromètre. Les échantillons dont les concentrations sont >1 ng/μL sont considérés comme optimaux pour la quantification et le séquençage de l’ADN.
  11. Effectuer une analyse qPCR pour cibler les virus entériques d’intérêt et un séquençage à haut débit pour identifier la structure de la communauté virale.

3. Précipitations directes et concentration des fractions microbiennes pour l’épidémiologie aqueuse

  1. Prélever 2 L d’échantillons d’eau dans les cours d’eau protégés et contaminés. Si l’échantillon contient une quantité considérable de débris, utilisez une étamine pour les enlever.
    REMARQUE : Il est fortement recommandé de prélever un double biologique par échantillon.
  2. Préparer une solution de lait écrémé à 1 % (p/v) en dissolvant 4,4 g de lait écrémé en poudre dans 440 mL d’eau de mer synthétique. Ajuster le pH de cette suspension à 3,5 avec 1 N HCl.
  3. Ajuster le pH des échantillons d’eau douce à 3,5 en utilisant 1 N HCl.
  4. Ajouter 20 ml de solution de lait écrémé aux échantillons d’eau douce de 2 L au pH précédemment ajusté (concentration finale de lait écrémé de 0,01 % [p/v]). Remuer les échantillons à température ambiante pendant 8 h.
  5. Laisser les flocs sédimenter par gravité pendant encore 8 heures. Retirez délicatement les surnageants à l’aide d’une pompe péristaltique. Transférer les flocs sédimentés dans un tube à centrifuger de 50 ml et les faire tourner à 8 000 x g pendant 30 minutes.
  6. Jeter le surnageant et remettre les pastilles en suspension avec 200 μL de tampon phosphate de sodium 0,2 M. Conservez les échantillons à -20 °C ou procédez à la sélection de ~ 0,5 g du floc pour l’extraction de l’ADN microbien en utilisant le kit d’isolation des acides nucléiques de votre choix, en suivant les instructions du fabricant.
  7. Déterminez la concentration et la pureté de l’acide nucléique de l’ADN à l’aide d’un fluoromètre à haute sensibilité. Les échantillons avec des concentrations >1 ng/μL devraient être optimaux pour la quantification et le séquençage de l’ADN.

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Representative Results

Évaluation des méthodes de concentration de l’ARN viral
Les six échantillons traités avec de l’UF-3k x g étaient positifs et ont donné lieu à une récupération de 13,38 % ± 8,14 % (figure 1). Un seul échantillon était positif lorsque les échantillons ont été traités avec de l’UF-7,5k x g. Tous les échantillons traités avec SMF étaient positifs et ont donné lieu à un taux de récupération de 15,27 % ± de 2,65 % (figure 1). Les taux de récupération moyens de l’UF-3K x g et de l’ESM étaient significativement et systématiquement (p < 0,0001) plus élevés que l’UF-7,5K x g. En revanche, il n’y avait pas de différence significative (p = 0,6240) entre les taux de récupération de l’UF-3K x g et de l’EMS. L’augmentation de la vitesse de centrifugation du dispositif centrifuge de marque B de 3 000 x g à 7 500 x g a entraîné une récupération plus faible, probablement due au passage de l’ARN blindé à travers les filtres à un taux accru et à la liaison des particules d’ARN blindé sur les filtres à une vitesse centrifuge accrue. L’élimination des particules solides avec des méthodes d’ultrafiltration pourrait expliquer les taux de récupération plus faibles des méthodes d’ultrafiltration contre SMF, compte tenu de la partition potentielle de l’ARN blindé dans les solides des eaux usées30. De plus, les paramètres physico-chimiques et biologiques des eaux usées (métadonnées) sont résumés dans le tableau 1. L’analyse de la FMS avec les eaux de surface (étape 2) a donné lieu à un taux de récupération plus élevé, de 42,7 % ± 15,1 %, ce qui indique que la répartition des virus en particules solides pourrait avoir eu une incidence importante sur le rétablissement compte tenu des faibles concentrations de solides dans les eaux de surface.

Filtration en série et concentration des virus
Le tableau 3 résume les paramètres de qualité de l’eau et les acides nucléiques extraits d’échantillons d’eau prélevés dans l’environnement à Winnipeg au cours de trois saisons. L’ADN était quantifiable dans tous les lieux d’échantillonnage et au fil des saisons. La figure supplémentaire 1 indique une carte avec les emplacements environnementaux des eaux de surface. D’autre part, les valeurs d’ARN étaient généralement inférieures à la limite de détection à l’aide d’un fluoromètre (<0,025 ng / μL). Ces extraits d’ARN ont été amplifiés au hasard pour générer de l’ADNc quantifiable pour le séquençage à haut débit (tableau 3).

Concentration des fractions microbiennes provenant d’échantillons d’eau dans l’environnement
La figure 2 et la figure 3 illustrent le flux de travail pour la méthodologie et la concentration des fractions microbiennes provenant d’échantillons d’eau de surface environnementale. Le tableau 4 contient la concentration moyenne d’ADN, l’écart-type et les conditions environnementales, comme le pH, la température, l’oxygène dissous, la pression atmosphérique, les précipitations et les heures de clarté des sites d’échantillonnage des cours d’eau protégés (forestiers) et touchés (urbains et agricoles) analysés dans cette recherche. Des échantillons ont été prélevés mensuellement d’avril 2022 à octobre 2022 dans les zones urbaines et rurales entourant la ville de Portage la Prairie, le long de la rivière Assiniboine, au Manitoba, au Canada. La concentration d’ADN la plus élevée a été observée dans le site forestier 1 et a donné 109,35-229,18 ng/μL. D’autre part, la plus faible concentration d’ADN microbien a été récupérée sur le site agricole 3 et avait une concentration moyenne de 19,83-22,05 ng / μL. La concentration moyenne d’ADN, l’écart-type et les métadonnées de tous les échantillons prélevés d’avril à octobre 2022 sont résumés dans le tableau 4. Les concentrations d’ADN obtenues étaient optimales pour d’autres applications en aval, notamment la PCR, la qPCR et le séquençage (données non présentées).

Figure 1
Figure 1 : Pourcentage de récupération et analyse statistique pour chaque méthode pour les échantillons d’eaux usées. Abréviations : SMF = floculation de lait écrémé; UF-3K x g = ultrafiltration à 3 000 x g; UF-7,5K x g = ultrafiltration à 7 500 x g. Les moyennes marquées d’un astérisque (*) indiquent des différences significatives au niveau de 0,05 entre les traitements; n = 6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Représentation schématique de la méthodologie utilisée pour concentrer et quantifier les virus des plans d’eau urbains du Manitoba qui reçoivent des effluents d’eaux usées. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Résumé graphique de la concentration de virus, de bactéries et de microeucaryotes pour la quantification et le séquençage de l’ADN. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Emplacements de 11 échantillons d’eau dans l’environnement. Des échantillons ont été prélevés le long des rivières Rouge et Assiniboine à Winnipeg, au Manitoba, comme l’indiquent les points rouges. Les trois principales usines de traitement des eaux usées de Winnipeg sont indiquées en bleu comme l’un des sites visités, même si aucun échantillonnage n’a eu lieu. Les sources des données sont Google maps et les logiciels Tableau. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau 1 : Paramètres de qualité de l’eau dans les échantillons influents de NESTP, SESTP et WESTP. Abréviations : NESTP = North End Sewage Treatment Plant; SESTP = Station de traitement des eaux usées du secteur sud; WESTP = Station de traitement des eaux usées de l’extrémité ouest; MLD = millions de litres par jour; TS = solides totaux; TSS = total des solides en suspension; DBO5 = demande biochimique en oxygène sur 5 jours; NH4-N = azote ammoniacal; TP = phosphore total; COT = carbone organique total; TN = azote total. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Ensembles d’amorces/sondes de tests RT-qPCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Paramètres de qualité de l’eau des rivières Rouge et Assiniboine lors du prélèvement d’échantillons au printemps le 16 mai, à l’été le 27 août et à l’automne le 21 novembre 2021) et quantification fluorométrique des acides nucléiques totaux (ADN et ARN). * La limite de détection du kit ARN est de 0,025 ng/μL ; ^ Les nombres représentent les valeurs de plage. Abréviations : DO = oxygène dissous; DBO 5 = demande biochimique en oxygène sur5 jours; TP = phosphore total. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : Paramètres de qualité de l’eau de la rivière Assiniboine pendant le prélèvement de l’échantillon (avril à octobre 2022). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

L’une des étapes critiques de cette étude est l’élimination des particules solides par l’application d’une étape de préfiltration avec des filtres à membrane de 0,2 μm et 0,45 μm. Compte tenu de la répartition des virus en particules solides, en particulier en virus enveloppés, la préfiltration peut entraîner une perte importante de récupérationvirale30. Alors qu’une étape de préfiltration pour les méthodes d’ultrafiltration est presque toujours nécessaire pour les échantillons environnementaux et d’eaux usées afin d’empêcher les dispositifs d’ultrafiltration de se boucher, la préfiltration pour les SMF peut être nécessaire selon le type d’analyse en aval. Pour les études PCR ciblées, la préfiltration peut ne pas être nécessaire. D’autre part, la préfiltration pourrait améliorer considérablement la métagénomique virale, car elle réduit le bruit de fond dans les viromes de fractions plus importantes telles que les microeucaryotes et les bactéries. Cette étape est essentielle pour le séquençage afin que les génomes plus grands n’essaiment pas le signal viral.

Le volume d’échantillon pouvant être traité par ultrafiltration séquentielle est limité à 140 mL. Il s’agit d’une limitation importante pour les échantillons à faible nombre de virus. D’autre part, SMF peut traiter des volumes d’échantillons beaucoup plus importants, ce qui augmente la probabilité de récupérer des virus.

Les taux de récupération de la SMF sont en accord avec d’autres études portant sur la concentration de particules virales dans les eaux usées. Des articles publiés précédemment ont rapporté des taux de récupération similaires avec une variété de virus test. Les taux de récupération moyens rapportés dans ces études variaient entre 3,4 % et 14 %13,31,32. La présente méthodologie faisait partie d’une autre étude portant sur le SRAS-CoV-2 dans les eaux usées par rapport au nombre de cas à Winnipeg33. La méthode SMF décrite ici a également été utilisée pour dépister l’ARN du SRAS-CoV-2 dans les lagunes d’oxydation des communautés rurales du Manitoba dans notre laboratoire. L’utilité de la méthode SMF a également été utilisée en combinaison avec la filtration en série (0,45 μm suivi de 0,2 μm et 0,1 μm) pour caractériser les communautés virales dans des échantillons d’eau douce prélevés en milieu urbain en utilisant le séquençage à haut débit dans notre laboratoire (décrit dans la deuxième section de la méthodologie). Enfin, la méthode SMF peut également être appliquée pour diriger la précipitation de communautés microbiennes, telles que les microeucaryotes, les bactéries et les virus à partir d’échantillons d’eau environnementale, et une caractérisation plus poussée à l’aide du séquençage en amplicon profond des gènes de l’ARNr 18S et de l’ARNr 16S, ainsi que du gène de la protéine de capside majeure (g23) de groupes viraux tels que les virus de type T4 (Zambrano et Uyaguari-Díaz, données non publiées). La méthode SMF permet de concentrer les fractions microbiennes présentes dans les échantillons d’eau à partir de grands volumes d’intrants (c.-à-d. 10 à 40 L) vers des volumes relativement plus petits (c.-à-d. 1 à 5 mL). Dans le cadre de cette méthodologie, l’eau ultrapure est également incluse en tant que contrôle négatif/de fond. Une fois que les fractions microbiennes sont concentrées, l’extraction des acides nucléiques peut être effectuée à l’aide de kits d’extraction commerciaux ou de protocoles internes. SMF représente une méthode polyvalente, relativement bon marché et facile à utiliser pour concentrer des fractions microbiennes ou des particules virales, sans différences significatives par rapport aux approches d’ultrafiltration ou de filtration à flux tangentiel.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer le travail rapporté dans cet article.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par la subvention Covid-19 de l’Alliance du CRSNG (bourse no 431401363, 2020-2021, Drs Yuan et Uyaguari-Díaz). MUD tient à remercier le Programme de subventions de recherche universitaire (prix no 325201). JF et JZA sont tous deux soutenus par le programme de formation des diplômés Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY et JF ont tous deux reçu des bourses du programme Mitacs Accélération. MUD et ses membres de laboratoire (KY, JF, JZA) sont soutenus par le GENSNG-DG (RGPIN-2022-04508) et la subvention de fonctionnement pour nouveaux chercheurs de Research Manitoba (no 5385). Un merci spécial à la Ville de Winnipeg, au Manitoba. Cette recherche a été menée à l’Université du Manitoba. Nous tenons à souligner que les campus de l’Université du Manitoba sont situés sur les terres originales des peuples Anishinaabeg, Cri, Oji-Cri, Dakota et Déné et sur la patrie de la Nation métisse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 Alfa Aesar J62041AP Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 66234 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 60043 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444432 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control Asuragen 49650 Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa Pall  OD030C65 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa Pall MCP010C46 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)  Nalgene 3119-0050PK Thermo Fisher Scientific
DNAse I Invitrogen 18047019 Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2 Invitrogen 12027 Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm Pall 12179 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution Thermo Fisher Scientific AC124210025 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit Applied biosystems A42358 Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water Promega P1197 Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump Masterflex, Cole-Parmer instrument 7553-20 Thermo Fisher Scientific
pH meter  Denver instrument RK-59503-25 Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 Invitrogen 15593031 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit Qiagen Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific A34322 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q33231 Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi Invitrogen Q33238 Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q32855 Thermo Fisher Scientific
RNAse A Invitrogen EN0531 Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit Qiagen 26000-50 Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder Difco (BD Life Sciences) DF0032173 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer Alfa Aesar Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater VWR  RC8363-1 RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4621 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4622 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol Gibco 21985023 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

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Concentration de particules virales provenant d’échantillons d’eau et d’eaux usées prélevés dans l’environnement par floculation et ultrafiltration du lait écrémé
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Yanaç, K., Francis, J.,… More

Yanaç, K., Francis, J., Zambrano-Alvarado, J., Yuan, Q., Uyaguari-Díaz, M. Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration. J. Vis. Exp. (193), e65058, doi:10.3791/65058 (2023).

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