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स्किम्ड मिल्क फ्लोक्यूलेशन और अल्ट्राफिल्ट्रेशन का उपयोग करके पर्यावरणीय जल और अपशिष्ट जल नमूनों से वायरस कणों की एकाग्रता

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65058
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2
1Department of Civil Engineering, Price Faculty of Engineering, University of Manitoba, 2Department of Microbiology, Faculty of Science, University of Manitoba

Summary

पर्यावरणीय जल और अपशिष्ट जल के नमूनों से वायरस एकाग्रता एक चुनौतीपूर्ण कार्य है, जो मुख्य रूप से वायरस की पहचान और परिमाणीकरण के लिए किया जाता है। जबकि कई वायरस एकाग्रता विधियों को विकसित और परीक्षण किया गया है, हम यहां विभिन्न नमूना प्रकारों के साथ आरएनए वायरस के लिए अल्ट्राफिल्ट्रेशन और स्किम्ड मिल्क फ्लोक्यूलेशन की प्रभावशीलता का प्रदर्शन करते हैं।

Abstract

जल और अपशिष्ट जल आधारित महामारी विज्ञान समुदायों में प्रकोप के पाठ्यक्रम की निगरानी और भविष्यवाणी करने के लिए वैकल्पिक तरीकों के रूप में उभरा है। अपशिष्ट जल और पर्यावरणीय जल के नमूनों से वायरस, बैक्टीरिया और माइक्रोयूकेरियोट्स सहित माइक्रोबियल अंशों की वसूली इन दृष्टिकोणों में चुनौतीपूर्ण चरणों में से एक है। इस अध्ययन में, हमने एक परीक्षण वायरस के रूप में बख्तरबंद आरएनए का उपयोग करके अनुक्रमिक अल्ट्राफिल्ट्रेशन और स्किम्ड मिल्क फ्लोक्यूलेशन (एसएमएफ) विधियों की वसूली दक्षता पर ध्यान केंद्रित किया, जिसका उपयोग कुछ अन्य अध्ययनों द्वारा नियंत्रण के रूप में भी किया जाता है। अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपकरणों के क्लॉगिंग को रोकने के लिए अल्ट्राफिल्ट्रेशन से पहले ठोस कणों को खत्म करने के लिए 0.45 μm और 0.2 μm झिल्ली डिस्क फिल्टर के साथ प्रीफिल्ट्रेशन लागू किया गया था। अनुक्रमिक अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधि के साथ संसाधित परीक्षण नमूने, दो अलग-अलग गति से सेंट्रीफ्यूज किए गए थे। एक बढ़ी हुई गति के परिणामस्वरूप बख्तरबंद आरएनए की कम वसूली और सकारात्मकता दर हुई। दूसरी ओर, एसएमएफ के परिणामस्वरूप बख्तरबंद आरएनए की अपेक्षाकृत सुसंगत वसूली और सकारात्मकता दर हुई। पर्यावरणीय पानी के नमूनों के साथ किए गए अतिरिक्त परीक्षणों ने अन्य माइक्रोबियल अंशों को केंद्रित करने के लिए एसएमएफ की उपयोगिता का प्रदर्शन किया। ठोस कणों में वायरस के विभाजन से समग्र वसूली दर पर प्रभाव पड़ सकता है, अपशिष्ट जल के नमूनों के अल्ट्राफिल्ट्रेशन से पहले लागू प्रीफिल्ट्रेशन चरण पर विचार करते हुए। नमूनों में कम ठोस सांद्रता के कारण पर्यावरणीय पानी के नमूनों पर लागू होने पर प्रीफिल्ट्रेशन के साथ एसएमएफ ने बेहतर प्रदर्शन किया और इस प्रकार ठोस पदार्थों के लिए कम विभाजन दर हुई। वर्तमान अध्ययन में, अनुक्रमिक अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधि का उपयोग करने का विचार कोविड-19 महामारी के दौरान वायरल सांद्रता की अंतिम मात्रा को कम करने की आवश्यकता से उत्पन्न हुआ, जब आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपकरणों की आपूर्ति सीमित थी, और वैकल्पिक वायरल एकाग्रता विधियों के विकास की आवश्यकता थी।

Introduction

माइक्रोबियल समुदाय विश्लेषण और महामारी विज्ञान अध्ययन के लिए सतह और अपशिष्ट जल के नमूनों में सूक्ष्मजीवों की प्रभावी एकाग्रता का निर्धारण करना, समुदायों में प्रकोप के पाठ्यक्रम की निगरानी और भविष्यवाणी करने के लिए महत्वपूर्ण कदमों में से एक है। कोविड-19 महामारी ने एकाग्रता के तरीकों में सुधार के महत्व को उजागर किया। कोविड-19 2019 के अंत में उभरा और मार्च 2023 तक, अभी भी मानव स्वास्थ्य, सामाजिक जीवन और अर्थव्यवस्था के लिए खतरा बना हुआ है। समुदायों में कोविड-19 के प्रकोप के प्रभावों को कम करने के लिए प्रभावी निगरानी और नियंत्रण रणनीतिएक महत्वपूर्ण शोध विषय बन गया है, क्योंकि वायरस के तेजी से संचरण और प्रसार के साथ-साथ बिना रिपोर्ट और बिना लक्षणवाले मामलों के अलावा सीओवीआईडी -19 की नई लहरें और वेरिएंट उभर रहे हैं।. नागरिक समाज संगठनों, सरकारी एजेंसियों और सार्वजनिक या निजी उपयोगिताओं द्वारा कोविड-19 के लिए अपशिष्ट जल आधारित महामारी विज्ञान का उपयोग तेजी से प्रकोप से संबंधित जानकारी प्रदान करने और कोविड-19 के प्रकोप के प्रभावों को कमकरने में सहायक रहा है। हालांकि, अपशिष्ट जल के नमूनों में सार्स-सीओवी-2, एक आवरण आरएनए वायरस की एकाग्रता अभीभी चुनौतियां पैदा करती है। उदाहरण के लिए, इन चुनौतियों में से एक अपशिष्ट जल ठोस पदार्थों में सार्स-सीओवी-2 का विभाजन है, जो एकाग्रता11 के दौरान ठोस पदार्थों को समाप्त करने पर वसूली को प्रभावित कर सकता है। यदि यह मामला है, तो परिमाणीकरण / मूल्यांकन का ध्यान केवल जलीय चरण के बजाय पर्यावरणीय पानी के नमूनों के ठोस और जलीय दोनों चरणों पर होना चाहिए। इसके अलावा, एकाग्रता विधि की पसंद को डाउनस्ट्रीम परीक्षणों और विश्लेषणों के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। पर्यावरणीय नमूनों से वायरस कणों और रोगजनकों की एकाग्रता अनुक्रमण और माइक्रोबायोम क्षेत्रों में विकास के साथ एक तत्काल शोध विषय बन गई है।

पर्यावरणीय जल और अपशिष्ट जल के नमूनों से वायरस एकाग्रता के क्षेत्र में विभिन्न वायरस एकाग्रता विधियों को लागू किया गया है। आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली कुछ विधियां निस्पंदन, स्किम्ड मिल्क फ्लोक्यूलेशन (एसएमएफ), सोखना / क्षालन, और पॉलीथीन ग्लाइकोल वर्षा12-17 हैं। उनमें से, एसएमएफ को एक सस्ता और प्रभावी तरीका माना गया है, जिसका सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया है, और अपशिष्ट जल और सतह के पानी से सार्स-सीओवी-2 सहित वायरस को पुनर्प्राप्त करनेके लिए लागू किया गया है। एसएमएफ प्रक्रिया एक अपेक्षाकृत नया दृष्टिकोण है जिसने कई पर्यावरणीय अध्ययनों के बीच सभी प्रकार के पानी के नमूनों, अर्थात् कीचड़, कच्चे सीवेज, अपशिष्ट जल और बहिस्त्रावके नमूनों से वायरस, बैक्टीरिया और प्रोटोजोआ जैसे सूक्ष्मजीवों की एक विस्तृत श्रृंखला को एक साथ पुनर्प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त पद्धति के रूप में बढ़ी हुई मान्यता प्राप्त की है।. जब अल्ट्राफिल्ट्रेशन और ग्लाइसिन-क्षारीय क्षालन, लियोफिलाइजेशन-आधारित दृष्टिकोण, या अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और ग्लाइसिन-क्षारीय क्षालन जैसे पर्यावरणीय नमूनों से वायरस को पुनर्प्राप्त करने के लिए अन्य ज्ञात पद्धतियों की तुलना में, एसएमएफ को उच्च वायरल रिकवरी और पहचान दर18,20 के साथ सबसे कुशल विधि के रूप में रिपोर्ट किया गया है।. वर्तमान अध्ययन में, हमने वायरस एकाग्रता विधियों की वसूली दक्षता का आकलन करने के लिए एक परीक्षण वायरस के रूप में बख्तरबंद आरएनए का उपयोग किया, जिसमें सार्स-सीओवी-2 रिकवरी21,22 का आकलन करने के लिए परीक्षण शामिल हैं।

यहां, हमने एसएमएफ की उपयोगिता और मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर), अनुक्रम-आधारित मेटाजेनोमिक्स और डीप-एम्प्लिकॉन अनुक्रमण के लिए माइक्रोबियल अंशों को केंद्रित करने के लिए एक अनुक्रमिक अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधि का प्रदर्शन करने के लिए अपशिष्ट जल और पर्यावरणीय जल के नमूनों का परीक्षण किया। एसएमएफ एक अपेक्षाकृत सस्ता तरीका है और अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधियों की तुलना में बड़ी मात्रा में नमूनों के लिए इष्टतम है। अनुक्रमिक अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधि का उपयोग करने का विचार कोविड-19 महामारी के दौरान वायरल सांद्रता की अंतिम मात्रा को कम करने की आवश्यकता से उत्पन्न हुआ, जब आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपकरणों की आपूर्ति सीमित थी, और वैकल्पिक वायरल एकाग्रता विधियों के विकास की आवश्यकता थी।

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Protocol

1. अपशिष्ट जल के नमूनों में वायरस को केंद्रित करने के लिए सीरियल अल्ट्राफिल्ट्रेशन और स्किम्ड दूध फ्लोक्यूलेशन की तुलना

  1. नमूना तैयार करना
    1. 24 घंटे के प्रवाह-आनुपातिक मिश्रित कच्चे (प्रवाह) अपशिष्ट जल के नमूने के 2 लीटर एकत्र करें। 2020 की गर्मियों और पतझड़ के दौरान विन्निपेग, कनाडा में तीन प्रमुख अपशिष्ट जल उपचार संयंत्रों (डब्ल्यूडब्ल्यूटीपी) से नमूने एकत्र किए गए थे (तालिका 1)।
    2. एक आइसबॉक्स में हल्के प्रूफ बोतलों में नमूने को प्रयोगशाला में ले जाएं और उन्हें 24 घंटे के भीतर संसाधित करें। अपशिष्ट जल भौतिक-रासायनिक और जैविक विशेषताओं के डेटा एकत्र करें।
  2. वायरस की सांद्रता का पता चलता है।
    नोट: एक अनुक्रमिक अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधि और एक कार्बनिक फ्लोक्यूलेशन विधि, अर्थात् स्किम्ड मिल्क फ्लोक्यूलेशन (एसएमएफ), एक परीक्षण वायरस के रूप में बख्तरबंद आरएनए का उपयोग करके प्रत्येक विधि की कुल वसूली दक्षता का आकलन करने के लिए लागू किया गया था।23. अन्य शोधकर्ताओं ने परिवार जैसे वायरस के लिए एकाग्रता विधियों की वसूली का आकलन करने के लिए एक नियंत्रण वायरस के रूप में बख्तरबंद आरएनए का भी उपयोग किया है। Coronaviridae22,24,25,26.
    1. बख्तरबंद आरएनए के अलावा, अल्ट्राफिल्ट्रेशन और एसएमएफ विधियों के लिए अपशिष्ट जल परीक्षण मात्रा क्रमशः 140 एमएल और 500 एमएल के रूप में सेट करें। एक पिपेटर का उपयोग करके, प्रत्येक अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधि के लिए एक तारीख को एकत्र किए गए छह ताजा अपशिष्ट जल नमूनों में बख्तरबंद आरएनए की 5 x 104 प्रतियां और दूसरी तारीख पर छह ताजा अपशिष्ट जल के नमूने स्पाइक करें; इसके अलावा, स्पाइक छह संग्रहीत (4 डिग्री सेल्सियस पर) अपशिष्ट जल के नमूने तीसरी, बाद की तारीख में एकत्र किए गए और एसएमएफ के लिए दिनों बाद संसाधित किए गए।
      नोट: विभिन्न तिथियों पर एकत्र किए गए छह नमूना सेटों में से प्रत्येक तीन डब्ल्यूडब्ल्यूटीपी में से प्रत्येक से दो नमूने से बना था। हमारे अध्ययन में, ताजा अपशिष्ट जल के नमूनों का पहला सेट 8 जुलाई, 2020 को एकत्र किया गया था, दूसरा 30 सितंबर, 2020 को, और अपशिष्ट जल के नमूने 14 अक्टूबर, 2020 को एसएमएफ के लिए संग्रहीत किए जानेथे।
    2. चुंबकीय हलचल का उपयोग करके नमूनों में बख्तरबंद आरएनए को टीका लगाने और समरूप करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए हिलाएं।
    3. 0.2 μm से बड़े सभी कणों या कोशिकाओं को हटा दें और अल्ट्राफिल्ट्रेशन करें।
      1. बड़े कणों, तलछट, यूकेरियोट्स और बैक्टीरिया 27 को हटाने के लिए क्रमशः चीज़क्लॉथ और कम-प्रोटीन बाइंडिंग, 0.45 μm और 0.2 μm,47 मिमी झिल्ली डिस्क फिल्टर के माध्यम से स्पाइक्ड अपशिष्ट जल के नमूने (प्रत्येक 140 एमएल स्पाइक्ड नमूने से 120 एमएल) को फ़िल्टर करें। नीचे वर्णित अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधियों का उपयोग करके फ़िल्टर किए गए नमूनों को संसाधित करें।
        नोट: 8 जुलाई और 30 सितंबर को एकत्र किए गए अपशिष्ट जल के नमूने क्रमशः 3,000 xg और 7,500 x g के साथ अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधियों के लिए उपयोगकिए गए थे।
      2. 3,000 x g (UF-3k x g) पर अनुक्रमिक अल्ट्राफिल्ट्रेशन के लिए, पहली तारीख को एकत्र किए गए परीक्षण नमूने के कुल 120 मिलीलीटर को 30 मिनट के लिए 3,000 x g पर एक ब्रांड ए केन्द्रापसारक उपकरण, 30-kDA का उपयोग करके नमूने के 60 मिलीलीटर को दो बार लगभग 5 मिलीलीटर में लोड करके केंद्रित करें। फिर, एक ब्रांड बी केन्द्रापसारक डिवाइस, 30-केडीए का उपयोग करके 30 मिनट के लिए 3,000 x g पर 5 एमएल वॉल्यूम को 500-1,200 μL पर केंद्रित करें।
      3. 7,500 x g (UF-7.5k x g) पर अनुक्रमिक अल्ट्राफिल्ट्रेशन के लिए, निर्माता की सिफारिशों के अनुसार छोटे अंतिम वॉल्यूम प्राप्त करने के लिए ब्रांड B केन्द्रापसारक डिवाइस के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन गति को 3,000 x g से 7,500 x g तक बदलें, और ब्रांड A केन्द्रापसारक डिवाइस की केन्द्रापसारक गति समान रखें।
        नोट: परीक्षण 30 सितंबर को एकत्र किए गए नमूनों के साथ चलाए गएथे।
    4. SMF के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    5. अपशिष्ट जल के नमूनों (प्रत्येक 500 एमएल) को एसएमएफ प्रोटोकॉल16,18 का उपयोग करके सीधे ध्यान केंद्रित करने के लिए स्पाइक करें, बिना चीज़क्लॉथ और कम-प्रोटीन बाइंडिंग झिल्ली डिस्क फिल्टर के साथ प्रीफिल्ट्रेशन के, जैसा कि नीचे वर्णित है।
    6. 1% (डब्ल्यू / वी) स्किम्ड दूध समाधान प्राप्त करने के लिए सिंथेटिक समुद्री जल के 50 मिलीलीटर में 0.5 ग्राम स्किम्ड दूध पाउडर घोलें और 1 एन एचसीएल का उपयोग करके समाधान के पीएच को सावधानीपूर्वक 3.5 तक समायोजित करें।
      नोट: अम्लीकरण वायरस को उनके आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु16 में परिवर्तन के कारण पानी से एकत्रित और अवक्षेपित करता है और दूध पाउडर28 की घुलनशीलता में सुधार करता है।
    7. 0.01% (डब्ल्यू / वी) की स्किम्ड दूध की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 500 एमएल कच्चे अपशिष्ट जल के नमूनों में 5 मिलीलीटर स्किम्ड दूध का घोल जोड़ें।
    8. नमूनों को मध्यम गति से 8 घंटे के लिए हिलाएं और गठित फ्लोक्स को कमरे के तापमान पर 8 घंटे के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
    9. बसे हुए फ्लोक्स को परेशान किए बिना सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वालों को सावधानीपूर्वक हटा दें। फ्लोक्स युक्त 50 एमएल की अंतिम मात्रा को सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 8 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 8,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    10. एक निष्फल स्पैटुला का उपयोग करके गोलियों को सावधानीपूर्वक स्क्रैप करें, और सतह पर तैरने वाले को हटाने के बाद 0.2 एम सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.5) के 250 μL में ट्यूबों में शेष छर्रों को फिर से निलंबित करें। स्क्रैप और पुन: निलंबित छर्रों को उसी 1.5 एमएल मिनी-सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  3. निष्कर्षण दक्षता में सुधार के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार, फिनोल: क्लोरोफॉर्म: आइसोमाइल अल्कोहल और β-मर्कैप्टोइथेनॉल के 25: 24: 1 अनुपात के साथ आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके अपशिष्ट जल के नमूनों के वायरल सांद्रता से वायरल आरएनए निष्कर्षण और वसूली दक्षता परख करें। अंत में, आरएनए को 50 μL क्षालन बफर में रखें।
  4. वास्तविक समय-मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) विश्लेषण
    1. सिंथेटिक एकल-फंसे डीएनए या जीब्लॉक निर्माण के दस गुना कमजोर पड़ने (7.8 x 104 से 7.8 जीन प्रतियां) का उपयोग करके बख्तरबंद आरएनए की मात्रा निर्धारित करें। बख्तरबंद आरएनए का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने वाले प्राइमरों और जांच सेटों के लिए तालिका 2 देखें।
    2. प्राइमर डिजाइन टूल29 का उपयोग करके प्राइमर और प्रोब सेट डिजाइन करें और बख्तरबंद आरएनए जीनोम के भीतर 95 बीपी क्षेत्र (जीब्लॉक निर्माण) को लक्षित करें।
    3. प्रत्येक आरटी-क्यूपीसीआर रन के लिए अंशांकन वक्र प्राप्त करें। प्रत्येक QPCR रन में नकारात्मक नियंत्रण शामिल करें। मानकों, नमूने, और गैर-टेम्पलेट नियंत्रणों को तीन प्रतियों में चलाएँ.
    4. प्रत्येक 10 μL RT-QPCR मिश्रण को निम्नलिखित क्रम में तैयार करें: 4x मास्टर मिश्रण का 2.5 μL, प्रत्येक प्राइमर का 400 nM, 200 nM प्रोब, और 2.5 μL टेम्पलेट, साथ ही अल्ट्राप्योर DNAse / RNAse- मुक्त आसुत जल।
    5. 5 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल साइक्लिंग प्रतिक्रियाएं करें, इसके बाद वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम पर 10 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के 45 चक्र करें। यदि सीटी <40 था, तो नमूना बख्तरबंद आरएनए सकारात्मक पर विचार करें।
    6. ह्यूमिक एसिड24 जैसे अवरोधकों या दूषित पदार्थों की संभावना का आकलन करने के लिए कच्चे सीवेज नमूनों के साथ गोजातीय सीरम एल्बुमिन का उपयोग करके क्यूपीसीआर और आरटी-क्यूपीसीआर परीक्षण करें। एंजाइम के साथ और बिना नमूनों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया।
  5. मानक वक्र से सांद्रता की गणना करें। पुनर्प्राप्त एकाग्रता को स्पाइक्ड एकाग्रता से विभाजित करके वसूली दक्षता प्रतिशत की गणना करें।
  6. विश्लेषण के लिए लॉग10 फ़ंक्शन का उपयोग करके जीन कॉपी संख्याओं को बदलें। QPCR डेटा पर एक सांख्यिकीय विश्लेषण उपकरण का उपयोग करके एक सामान्य रैखिक मॉडल चलाएं। विधियों और उपचारों के बीच अंतर का पता लगाने के लिए ट्यूकी के परीक्षण को लागू करें। परीक्षण के लिए न्यूनतम महत्व स्तर होने के लिए 0.05 का पी-मान लें।

2. पानी आधारित महामारी विज्ञान के लिए डीएनए और आरएनए वायरस का निस्पंदन और एकाग्रता

  1. पर्यावरणीय सतह जल संग्रह के लिए, 10 एल पर्यावरणीय सतह के पानी के नमूने एकत्र करें और पृष्ठभूमि नियंत्रण के लिए 10 एल विआयनीकृत पानी के नमूनों का उपयोग करें। नमूना संग्रह के बाद 24 घंटे के भीतर प्रसंस्करण तक सभी नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस कमरे में स्टोर करें।
  2. नीचे वर्णित चरणों का उपयोग करके एसएमएफ के साथ पर्यावरणीय नमूनों से वायरस की एकाग्रता करें।
    1. मेटाजेनोमिक अनुक्रमण के दौरान शोर को कम करने के लिए 0.45 μm, 0.2 μm, और 0.1 μm आकार के उच्च क्षमता वाले भूजल नमूना कैप्सूल और झिल्ली डिस्क फिल्टर का उपयोग करके कैप्सूल और वैक्यूम निस्पंदन करें, माइक्रो-यूकेरियोट्स और बैक्टीरिया जैसे बड़े अंशों से लेकर वायरस जैसे छोटे लोगों तक।
    2. 13.2 ग्राम स्किम्ड मिल्क पाउडर के साथ 1.32 लीटर सिंथेटिक समुद्री जल में 1% वजन-दर-मात्रा प्री-फ्लोकुलेटेड स्किम्ड दूध समाधान तैयार करें। 1 एन एचसीएल का उपयोग करके इस निलंबन के पीएच को 3.5 तक समायोजित करें।
  3. 1 एन एचसीएल का उपयोग करके पर्यावरणीय सतह के पानी के नमूनों के पीएच को 3.5 तक समायोजित करें।
  4. प्री-फ्लोकुलेटेड एसिडिफाइड स्किम्ड मिल्क घोल के 100 एमएल को 10 एल अम्लीय (पीएच 3.5) पर्यावरणीय पानी के नमूनों (अंतिम स्किम्ड दूध सांद्रता 0.01% [डब्ल्यू / वी]) में स्थानांतरित करें।
  5. एक चुंबकीय हलचल और एक चुंबकीय हलचल बार का उपयोग करके, कमरे के तापमान पर 8 घंटे के लिए नमूने को हिलाएं और अतिरिक्त 8 घंटे के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा फ्लोक्स को तलछट की अनुमति दें। फ्लोक्स को परेशान किए बिना, वैक्यूम पंप का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाले को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  6. 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में वजन के अनुसार शेष फ्लोक्स को एलिकोट और संतुलित करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 8,000 x g पर घुमाएं।
  7. सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और परिणामी गोली (जिसमें सैद्धांतिक रूप से रुचि के वायरस होते हैं) को 0.2 एम सोडियम फॉस्फेट बफर के 200 μL में भंग करें।
  8. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, विघटित गोली को DNase I और RNase A के साथ इलाज करें, ताकि मुक्त डीएनए और आरएनए मौजूद को खत्म किया जा सके जो न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए उपयोग की जाने वाली किट के कारण सह-अवक्षेपित हो सकते हैं। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए DNase I और RNase A को निष्क्रिय करें।
  9. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, डीएनए / आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके विघटित गोली से कुल न्यूक्लिक एसिड निकालें।
  10. फ्लोरोमीटर का उपयोग करके बहिस्त्राव के नमूनों से निकाले गए डीएनए और आरएनए की कुल मात्रा निर्धारित करें। >1 ng / μL सांद्रता वाले नमूने डीएनए परिमाणीकरण और अनुक्रमण के लिए इष्टतम माना जाता है।
  11. वायरल समुदाय संरचना की पहचान करने के लिए रुचि के एंटरिक वायरस और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण को लक्षित करने के लिए क्यूपीसीआर विश्लेषण करें।

3. जल-आधारित महामारी विज्ञान के लिए माइक्रोबियल अंशों की प्रत्यक्ष वर्षा और एकाग्रता

  1. संरक्षित और प्रभावित जलमार्गों से 2 लीटर पानी के नमूने एकत्र करें। यदि नमूने में काफी मात्रा में मलबे हैं, तो उन्हें हटाने के लिए चीज़क्लॉथ का उपयोग करें।
    नोट: प्रति नमूना एक जैविक डुप्लिकेट एकत्र करना अत्यधिक अनुशंसित है।
  2. 440 मिलीलीटर सिंथेटिक समुद्री जल में 4.4 ग्राम स्किम्ड दूध पाउडर घोलकर 1% (डब्ल्यू / वी) स्किम्ड दूध का घोल तैयार करें। 1 एन एचसीएल के साथ इस निलंबन के पीएच को 3.5 तक समायोजित करें।
  3. 1 एन एचसीएल का उपयोग करके मीठे पानी के नमूनों के पीएच को 3.5 तक समायोजित करें।
  4. पहले पीएच-समायोजित 2 एल मीठे पानी के नमूनों में 20 एमएल स्किम्ड दूध समाधान जोड़ें (अंतिम स्किम्ड दूध एकाग्रता 0.01% [डब्ल्यू / वी])। नमूने को 8 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हिलाएं।
  5. फ्लोक्स को एक और 8 घंटे के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा तलछट की अनुमति दें। एक पेरिस्टालिक पंप के साथ सतह पर तैरने वालों को सावधानीपूर्वक हटा दें। तलछट वाले फ्लोक्स को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और उन्हें 30 मिनट के लिए 8,000 एक्स जी पर घुमाएं।
  6. सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और 0.2 एम सोडियम फॉस्फेट बफर के 200 μL के साथ छर्रों को फिर से निलंबित करें। नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए पसंद के न्यूक्लिक एसिड आइसोलेशन किट का उपयोग करके माइक्रोबियल डीएनए निष्कर्षण के लिए ~ 0.5 ग्राम फ्लोक का चयन करने के लिए आगे बढ़ें।
  7. उच्च संवेदनशीलता फ्लोरोमीटर के साथ डीएनए न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता और शुद्धता निर्धारित करें। >1 एनजी / μL सांद्रता वाले नमूने डीएनए परिमाणीकरण और अनुक्रमण के लिए इष्टतम होना चाहिए।

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Representative Results

वायरल आरएनए एकाग्रता विधियों का मूल्यांकन
यूएफ -3 के एक्स जी के साथ संसाधित सभी छह नमूने सकारात्मक थे और इसके परिणामस्वरूप 13.38% ± 8.14% वसूली हुई (चित्रा 1)। केवल एक नमूना सकारात्मक था जब नमूने यूएफ -7.5 के एक्स जी के साथ संसाधित किए गए थे। एसएमएफ के साथ संसाधित सभी नमूने सकारात्मक थे और इसके परिणामस्वरूप 15.27% ± 2.65% रिकवरी हुई (चित्रा 1)। यूएफ -3 के एक्स जी और एसएमएफ की औसत वसूली दर यूएफ -7.5 के एक्स जी की तुलना में काफी और लगातार (पी < 0.0001) अधिक थी। दूसरी ओर, यूएफ -3 के एक्स जी और एसएमएफ की वसूली दरों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर (पी = 0.6240) नहीं था। ब्रांड बी केन्द्रापसारक डिवाइस की केन्द्रापसारक गति को 3,000 x g से 7,500 x g तक बढ़ाने के परिणामस्वरूप कम वसूली हुई, शायद बढ़ी हुई दर पर फिल्टर के माध्यम से बख्तरबंद आरएनए के पारित होने और केन्द्रापसारक गति में फिल्टर पर बख्तरबंद आरएनए कणों के बंधन के कारण। अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधियों के साथ ठोस कणों को खत्म करने से एसएमएफ के खिलाफ अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधियों की कम वसूली दर की व्याख्या होसकती है, अपशिष्ट जल ठोस पदार्थों में बख्तरबंद आरएनए के संभावित विभाजन पर विचार करते हुए। इसके अतिरिक्त, भौतिक रासायनिक और जैविक अपशिष्ट जल पैरामीटर (मेटाडेटा) को तालिका 1 में संक्षेपित किया गया है। सतह के पानी (चरण 2) के साथ एसएमएफ का परीक्षण करने के परिणामस्वरूप उच्च वसूली दर, 42.7% ± 15.1% हुई, यह दर्शाता है कि ठोस कणों में वायरस को विभाजित करने से सतह के पानी में कम ठोस सांद्रता पर विचार करते हुए वसूली काफी प्रभावित हो सकती है।

सीरियल निस्पंदन और वायरस की एकाग्रता
तालिका 3 तीन मौसमों में विन्निपेग के भीतर एकत्र किए गए पर्यावरणीय पानी के नमूनों से निकाले गए पानी की गुणवत्ता मापदंडों और न्यूक्लिक एसिड को सारांशित करती है। डीएनए सभी नमूना स्थानों और मौसमों में मात्रात्मक था। पूरक चित्र 1 पर्यावरणीय सतही जल स्थानों के साथ एक मानचित्र इंगित करता है। दूसरी ओर, आरएनए मान ज्यादातर फ्लोरोमीटर (<0.025 एनजी / μL) का उपयोग करके पता लगाने की सीमा से नीचे थे। इन आरएनए अर्क को उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए मात्रात्मक सीडीएनए उत्पन्न करने के लिए यादृच्छिक रूप से प्रवर्धित किया गया था (तालिका 3)।

पर्यावरणीय जल नमूनों से माइक्रोबियल अंशों की सांद्रता।
चित्र 2 और चित्र 3 पर्यावरणीय सतह के पानी के नमूनों से माइक्रोबियल अंशों की कार्यप्रणाली और एकाग्रता के लिए वर्कफ़्लो को दर्शाते हैं। तालिका 4 में औसत डीएनए एकाग्रता, मानक विचलन और पर्यावरणीय परिस्थितियों, जैसे पीएच, तापमान, घुलित ऑक्सीजन, वायुमंडलीय दबाव, वर्षा, और इस शोध में विश्लेषण किए गए संरक्षित (वनाच्छादित) और प्रभावित (शहरी और कृषि) जलमार्गों के नमूना स्थलों के दिन के उजाले के समय शामिल हैं। कनाडा के मैनिटोबा में असिनिबोइन नदी के किनारे पोर्टेज ला प्रेयरी शहर के आसपास के शहरी और ग्रामीण क्षेत्रों में अप्रैल 2022 से अक्टूबर 2022 तक मासिक रूप से नमूने एकत्र किए गए थे। सबसे अधिक डीएनए सांद्रता वनाच्छादित साइट 1 में देखी गई थी और 109.35-229.18 एनजी / दूसरी ओर, सबसे कम माइक्रोबियल डीएनए एकाग्रता कृषि स्थल 3 से बरामद की गई थी और इसकी औसत एकाग्रता 19.83-22.05 एनजी / अप्रैल से अक्टूबर 2022 तक एकत्र किए गए सभी नमूनों की औसत डीएनए एकाग्रता, मानक विचलन और मेटाडेटा को तालिका 4 में संक्षेपित किया गया है। प्राप्त डीएनए सांद्रता अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए इष्टतम थी, जिसमें पीसीआर, क्यूपीसीआर और अनुक्रमण (डेटा नहीं दिखाया गया) शामिल हैं।

Figure 1
चित्रा 1: अपशिष्ट जल के नमूनों के लिए प्रत्येक विधि के लिए प्रतिशत वसूली और सांख्यिकीय विश्लेषण। संक्षेप: एसएमएफ = स्किम्ड दूध फ्लोक्यूलेशन; यूएफ -3 के एक्स जी = 3,000 एक्स जी पर अल्ट्राफिल्ट्रेशन; UF-7.5K x g = 7,500 x g पर अल्ट्राफिल्ट्रेशन। तारांकन (*) वाले साधन उपचार में 0.05 स्तर पर महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं; n = 6. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मैनिटोबा के शहरी जल निकायों से वायरस को केंद्रित करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व जो अपशिष्ट जल प्रवाह प्राप्त करते हैं। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: डीएनए परिमाणीकरण और अनुक्रमण के लिए वायरस, बैक्टीरिया और माइक्रोयूकेरियोट्स की एकाग्रता का ग्राफिकल सार। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: 11 पर्यावरणीय जल नमूनों के स्थान। विन्निपेग, मैनिटोबा में लाल और असिनिबोइन नदियों के किनारे नमूने एकत्र किए गए थे, जैसा कि लाल बिंदुओं से संकेत मिलता है। विन्निपेग के तीन प्रमुख सीवेज उपचार संयंत्रों को नीले रंग में इंगित किया गया है क्योंकि उन साइटों में से एक का दौरा किया गया है, भले ही कोई नमूना घटना नहीं हुई। डेटा के स्रोत गूगल मैप्स और झांकी सॉफ्टवेयर हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: एनईएसपी, एसईएसटीपी और वेस्टपी के असंगत नमूनों में पानी की गुणवत्ता के पैरामीटर। संक्षेप: एनईएसपी = नॉर्थ एंड सीवेज ट्रीटमेंट प्लांट; एसईएसटीपी = साउथ एंड सीवेज ट्रीटमेंट प्लांट; वेस्टपी = वेस्ट एंड सीवेज ट्रीटमेंट प्लांट; एमएलडी = मिलियन लीटर प्रति दिन; टीएस = कुल ठोस; टीएसएस = कुल निलंबित ठोस; बीओडी 5 = 5 दिन जैव रासायनिक ऑक्सीजन की मांग; एनएच4-एन = अमोनियम-नाइट्रोजन; टीपी = कुल फास्फोरस; टीओसी = कुल कार्बनिक कार्बन; टीएन = कुल नाइट्रोजन। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: आरटी-क्यूपीसीआर परख के प्राइमर/प्रोब सेट। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: 16 मई को वसंत में नमूना संग्रह के दौरान लाल और एसिनिबोइन नदियाँ जल गुणवत्ता पैरामीटर, 27 अगस्त को गर्मी, और 21 नवंबर, 2021 को पतन) और कुल न्यूक्लिक एसिड (डीएनए और आरएनए) के फ्लोरोमीटर परिमाणीकरण। * आरएनए किट की पहचान सीमा 0.025 एनजी / - ^ संख्याएं सीमा मूल्यों का प्रतिनिधित्व करती हैं। संक्षेप: डीओ = घुलित ऑक्सीजन; बीओडी 5 =5 दिन जैव रासायनिक ऑक्सीजन की मांग; टीपी = कुल फॉस्फोरस। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 4: नमूना संग्रह (अप्रैल से अक्टूबर 2022) के दौरान एसिनिबोइन नदी के पानी की गुणवत्ता के पैरामीटर। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन में महत्वपूर्ण चरणों में से एक 0.2 μm और 0.45 μm झिल्ली फिल्टर के साथ एक प्रीफिल्ट्रेशन चरण लागू करके ठोस कणों का उन्मूलन है। ठोस कणों, विशेष रूप से घिरे वायरस में वायरस के विभाजन को ध्यान में रखते हुए, प्रीफिल्ट्रेशन वायरल रिकवरी30 में महत्वपूर्ण नुकसान का कारण बन सकता है। जबकि अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधियों के लिए एक प्रीफिल्ट्रेशन कदम पर्यावरण और अपशिष्ट जल के नमूनों के लिए लगभग हमेशा आवश्यक होता है ताकि अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपकरणों को बंद होने से रोका जा सके, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के प्रकार के आधार पर एसएमएफ के लिए प्रीफिल्ट्रेशन की आवश्यकता हो सकती है। लक्षित पीसीआर अध्ययनों के लिए, प्रीफिल्ट्रेशन की आवश्यकता नहीं हो सकती है। दूसरी ओर, प्रीफिल्ट्रेशन वायरल मेटाजेनोमिक्स में काफी सुधार कर सकता है, क्योंकि यह माइक्रोयूकेरियोट्स और बैक्टीरिया जैसे बड़े अंशों से वाइरोम में पृष्ठभूमि शोर को कम करता है। यह कदम अनुक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है ताकि बड़े जीनोम वायरल सिग्नल को झुंड न करें।

अनुक्रमिक अल्ट्राफिल्ट्रेशन के साथ संसाधित किया जा सकने वाला नमूना वॉल्यूम 140 एमएल तक सीमित है। यह कम वायरस की गिनती वाले नमूनों के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा है। दूसरी ओर, एसएमएफ बहुत बड़े नमूना वॉल्यूम को संसाधित कर सकता है, जिससे वायरस को पुनर्प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है।

एसएमएफ की वसूली दर अपशिष्ट जल से वायरल कणों की एकाग्रता पर ध्यान केंद्रित करने वाले अन्य अध्ययनों के साथ समझौते में हैं। पहले प्रकाशित पत्रों ने विभिन्न प्रकार के परीक्षण वायरस के साथ समान वसूली दर की सूचना दी। इन अध्ययनों में रिपोर्ट की गई औसत वसूली दर 3.4% और 14% 13,31,32 के बीच थी। वर्तमान पद्धति विन्निपेग33 में मामलों की संख्या के संबंध में अपशिष्ट जल में सार्स-सीओवी-2 की जांच करने वाले एक अन्य अध्ययन का एक हिस्सा थी। यहां वर्णित एसएमएफ विधि का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में मैनिटोबा के ग्रामीण समुदायों से ऑक्सीकरण लैगून में सार्स-सीओवी-2 आरएनए की जांच के लिए भी किया गया है। एसएमएफ विधि की उपयोगिता का उपयोग सीरियल निस्पंदन (0.45 μm के बाद 0.2 μm और 0.1 μm) के संयोजन में भी किया गया है ताकि हमारी प्रयोगशाला में उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण का उपयोग करके शहरी सेटिंग्स से मीठे पानी के नमूनों में वायरल समुदायों को चिह्नित किया जा सके (पद्धति के दूसरे खंड में वर्णित)। अंत में, एसएमएफ विधि को माइक्रोबियल समुदायों की वर्षा को निर्देशित करने के लिए भी लागू किया जा सकता है, जैसे कि पर्यावरणीय पानी के नमूनों से माइक्रोयूकेरियोट्स, बैक्टीरिया और वायरस, और 18 एस आरआरएनए और 16 एस आरआरएनए जीन के डीप-एम्प्लिकॉन अनुक्रमण का उपयोग करके आगे लक्षण वर्णन, साथ ही वायरल समूहों के प्रमुख कैप्सिड प्रोटीन जीन (जी 23) जैसे टी 4 जैसे वायरस (ज़म्ब्रानो और उयागुआरी-डिआज)। अप्रकाशित डेटा)। एसएमएफ विधि पानी के नमूनों में मौजूद माइक्रोबियल अंशों को बड़े इनपुट वॉल्यूम (यानी, 10-40 एल) से अपेक्षाकृत छोटी मात्रा (यानी, 1-5 एमएल) में केंद्रित करने में सक्षम बनाती है। इस पद्धति के भाग के रूप में, अल्ट्राप्योर पानी को नकारात्मक / पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में भी शामिल किया गया है। एक बार माइक्रोबियल अंशों को नीचे केंद्रित करने के बाद, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण वाणिज्यिक निष्कर्षण किट या इन-हाउस प्रोटोकॉल का उपयोग करके आयोजित किया जा सकता है। एसएमएफ माइक्रोबियल अंशों या वायरल कणों को केंद्रित करने के लिए एक बहुमुखी, अपेक्षाकृत सस्ता और आसान / हैंड-ऑफ विधि का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें अल्ट्राफिल्ट्रेशन या स्पर्शरेखीय प्रवाह निस्पंदन दृष्टिकोण की तुलना में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई ज्ञात प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या व्यक्तिगत संबंध नहीं हैं जो इस पेपर में रिपोर्ट किए गए काम को प्रभावित कर सकते थे।

Acknowledgments

इस काम को एनएसईआरसी एलायंस कोविड -19 ग्रांट (अवार्ड नंबर 431401363, 2020-2021, डॉ युआन और उयागुआरी-डिआज) द्वारा समर्थित किया गया था। एमयूडी विश्वविद्यालय अनुसंधान अनुदान कार्यक्रम (पुरस्कार संख्या 325201) को धन्यवाद देना चाहता है। जेएफ और जेजेडए दोनों दृश्य और स्वचालित रोग विश्लेषिकी (वाडा) स्नातक प्रशिक्षण कार्यक्रम द्वारा समर्थित हैं। केवाई और जेएफ दोनों को मिटैक्स एक्सिलरेट कार्यक्रम से फैलोशिप मिली। एमयूडी और उनके प्रयोगशाला सदस्यों (केवाई, जेएफ, जेजेडए) को एनएसईआरसी-डीजी (आरजीपीआईएन-2022-04508) और रिसर्च मैनिटोबा न्यू इन्वेस्टिगेटर ऑपरेटिंग ग्रांट (संख्या 5385) द्वारा समर्थित किया जाता है। विन्निपेग, मैनिटोबा शहर के लिए विशेष धन्यवाद। यह शोध मैनिटोबा विश्वविद्यालय में किया गया था। हम यह स्वीकार करना चाहते हैं कि मैनिटोबा विश्वविद्यालय के परिसर अनीशिनाबेग, क्री, ओजी-क्री, डकोटा और डेने लोगों की मूल भूमि पर और मेटिस राष्ट्र की मातृभूमि पर स्थित हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 Alfa Aesar J62041AP Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 66234 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 60043 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444432 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control Asuragen 49650 Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa Pall  OD030C65 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa Pall MCP010C46 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)  Nalgene 3119-0050PK Thermo Fisher Scientific
DNAse I Invitrogen 18047019 Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2 Invitrogen 12027 Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm Pall 12179 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution Thermo Fisher Scientific AC124210025 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit Applied biosystems A42358 Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water Promega P1197 Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump Masterflex, Cole-Parmer instrument 7553-20 Thermo Fisher Scientific
pH meter  Denver instrument RK-59503-25 Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 Invitrogen 15593031 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit Qiagen Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific A34322 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q33231 Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi Invitrogen Q33238 Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q32855 Thermo Fisher Scientific
RNAse A Invitrogen EN0531 Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit Qiagen 26000-50 Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder Difco (BD Life Sciences) DF0032173 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer Alfa Aesar Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater VWR  RC8363-1 RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4621 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4622 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol Gibco 21985023 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

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References

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Yanaç, K., Francis, J., Zambrano-Alvarado, J., Yuan, Q., Uyaguari-Díaz, M. Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration. J. Vis. Exp. (193), e65058, doi:10.3791/65058 (2023).

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