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Konzentration von Viruspartikeln aus Wasser- und Abwasserproben aus der Umwelt mittels Magermilchflockung und Ultrafiltration

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65058
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2
1Department of Civil Engineering, Price Faculty of Engineering, University of Manitoba, 2Department of Microbiology, Faculty of Science, University of Manitoba

Summary

Die Viruskonzentration aus Wasser- und Abwasserproben aus der Umwelt ist eine anspruchsvolle Aufgabe, die vor allem zur Identifizierung und Quantifizierung von Viren durchgeführt wird. Während mehrere Methoden zur Viruskonzentration entwickelt und getestet wurden, demonstrieren wir hier die Wirksamkeit der Ultrafiltration und der Magermilchflockung für RNA-Viren mit verschiedenen Probentypen.

Abstract

Die wasser- und abwasserbasierte Epidemiologie hat sich als alternative Methode zur Überwachung und Vorhersage des Verlaufs von Ausbrüchen in Gemeinden herausgestellt. Die Rückgewinnung mikrobieller Fraktionen, einschließlich Viren, Bakterien und Mikroeukaryoten, aus Abwasser- und Umweltwasserproben ist einer der herausfordernden Schritte bei diesen Ansätzen. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Rückgewinnungseffizienz von sequenziellen Ultrafiltrations- und Magermilchflockungsmethoden (SMF) unter Verwendung von gepanzerter RNA als Testvirus, das auch von einigen anderen Studien als Kontrolle verwendet wird. Die Vorfiltration mit 0,45 μm und 0,2 μm Membranscheibenfiltern wurde eingesetzt, um Feststoffpartikel vor der Ultrafiltration zu eliminieren und ein Verstopfen der Ultrafiltrationsgeräte zu verhindern. Testproben, die mit der sequentiellen Ultrafiltrationsmethode verarbeitet wurden, wurden mit zwei verschiedenen Geschwindigkeiten zentrifugiert. Eine erhöhte Geschwindigkeit führte zu niedrigeren Wiederfindungs- und Positivitätsraten von gepanzerter RNA. Auf der anderen Seite führte SMF zu relativ konsistenten Wiederfindungs- und Positivitätsraten von gepanzerter RNA. Zusätzliche Tests, die mit Wasserproben aus der Umwelt durchgeführt wurden, zeigten den Nutzen von SMF zur Konzentration anderer mikrobieller Fraktionen. Die Aufteilung von Viren in feste Partikel kann sich auf die Gesamtrückgewinnungsraten auswirken, wenn man den Vorfiltrationsschritt berücksichtigt, der vor der Ultrafiltration von Abwasserproben durchgeführt wird. SMF mit Vorfiltration schnitt bei der Anwendung auf Umweltwasserproben aufgrund geringerer Feststoffkonzentrationen in den Proben und damit geringerer Aufteilungsraten in Feststoffe besser ab. In der vorliegenden Studie entstand die Idee, ein sequentielles Ultrafiltrationsverfahren zu verwenden, aus der Notwendigkeit, das Endvolumen der Viruskonzentrate während der COVID-19-Pandemie zu verringern, als das Angebot an den üblicherweise verwendeten Ultrafiltrationsgeräten begrenzt war und die Entwicklung alternativer Viruskonzentrationsmethoden erforderlich war.

Introduction

Die Bestimmung der effektiven Konzentration von Mikroorganismen in Oberflächen- und Abwasserproben für die Analyse mikrobieller Gemeinschaften und epidemiologische Studien ist einer der wichtigsten Schritte zur Überwachung und Vorhersage des Verlaufs von Ausbrüchen in Gemeinschaften 1,2. Die COVID-19-Pandemie hat gezeigt, wie wichtig es ist, die Konzentrationsmethoden zu verbessern. COVID-19 trat Ende 2019 auf und stellt im März 2023 immer noch eine Bedrohung für die menschliche Gesundheit, das soziale Leben und die Wirtschaft dar. Wirksame Überwachungs- und Kontrollstrategien zur Abmilderung der Auswirkungen von COVID-19-Ausbrüchen in Gemeinschaften sind zu einem wichtigen Forschungsthema geworden, da neben der schnellen Übertragung und Ausbreitung des Virus auch neue Wellen und Varianten von COVID-19 sowie nicht gemeldete und nicht diagnostizierte asymptomatische Fälle aufgetaucht sind 3,4,5. Der Einsatz der abwasserbasierten Epidemiologie für COVID-19 durch zivilgesellschaftliche Organisationen, Regierungsbehörden und öffentliche oder private Versorgungsunternehmen hat sich als hilfreich erwiesen, um schnelle Informationen über den Ausbruch bereitzustellen und die Auswirkungen von COVID-19-Ausbrüchen abzumildern 6,7,8,9. Die Konzentration von SARS-CoV-2, einem behüllten RNA-Virus, in Abwasserproben stellt jedoch nach wie vor eine Herausforderungdar 10. Eine dieser Herausforderungen ist beispielsweise die Aufteilung von SARS-CoV-2 in Abwasserfeststoffen, was sich auf die Rückgewinnung auswirken kann, wenn die Feststoffe während der Konzentration11 eliminiert werden. Wenn dies der Fall ist, sollte der Schwerpunkt der Quantifizierung/Bewertung sowohl auf der festen als auch auf der wässrigen Phase von Umweltwasserproben liegen und nicht nur auf der wässrigen Phase. Darüber hinaus kann die Wahl der Konzentrationsmethode auf der Grundlage nachgelagerter Tests und Analysen modifiziert werden. Die Konzentration von Viruspartikeln und Krankheitserregern aus Umweltproben ist mit Entwicklungen in den Bereichen Sequenzierung und Mikrobiom zu einem dringenden Forschungsthema geworden.

Im Bereich der Viruskonzentration aus Wasser- und Abwasserproben aus der Umwelt wurden verschiedene Methoden der Viruskonzentration angewendet. Einige häufig verwendete Methoden sind Filtration, Magermilchflockung (SMF), Adsorption/Elution und Polyethylenglykolfällung12-17. Unter ihnen wurde SMF als kostengünstige und effektive Methode angesehen, erfolgreich getestet und zur Gewinnung von Viren, einschließlich SARS-CoV-2, aus Abwasser und Oberflächengewässern eingesetzt 12,15,16,18. Das SMF-Verfahren ist ein relativ neuer Ansatz, der in vielen Umweltstudien zunehmend als geeignete Methode zur gleichzeitigen Gewinnung eines breiten Spektrums von Mikroorganismen wie Viren, Bakterien und Protozoen aus allen Arten von Wasserproben, nämlich Schlamm, Rohabwasser, Abwasser und Abwasserproben, anerkannt wurde19. Im Vergleich zu anderen bekannten Methoden zur Rückgewinnung von Viren aus Umweltproben wie Ultrafiltration und Glycin-Alkali-Elution, Lyophilisations-basierter Ansatz oder Ultrazentrifugation und Glycin-Alkali-Elution wurde SMF als die effizienteste Methode mit höheren viralen Rückgewinnungs- und Nachweisraten beschrieben18,20. In der vorliegenden Studie haben wir gepanzerte RNA als Testvirus verwendet, um die Rückgewinnungseffizienz von Viruskonzentrationsmethoden zu bewerten, einschließlich Tests zur Bewertung der SARS-CoV-2-Erholung21,22.

Hier testeten wir Abwasser- und Umweltwasserproben, um den Nutzen von SMF und einer sequentiellen Ultrafiltrationsmethode zur Konzentration mikrobieller Fraktionen für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), sequenzbasierte Metagenomik und Deep-Amplicon-Sequenzierung zu demonstrieren. SMF ist eine relativ kostengünstigere Methode und im Vergleich zu Ultrafiltrationsmethoden optimal für ein größeres Probenvolumen. Die Idee, ein sequentielles Ultrafiltrationsverfahren zu verwenden, entstand aus der Notwendigkeit, das Endvolumen der Viruskonzentrate während der COVID-19-Pandemie zu verringern, als das Angebot an den üblicherweise verwendeten Ultrafiltrationsgeräten begrenzt war und die Entwicklung alternativer Viruskonzentrationsmethoden erforderlich war.

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Protocol

1. Vergleich von serieller Ultrafiltration und Magermilchflockung zur Aufkonzentrierung von Viren in Abwasserproben

  1. Probenvorbereitung
    1. Sammeln Sie 2 l 24 h durchflussproportionale zusammengesetzte (Zulauf-)Abwasserproben. Die Proben wurden im Sommer und Herbst 2020 in den drei großen Kläranlagen (ARA) in Winnipeg, Kanada, entnommen (Tabelle 1).
    2. Transportieren Sie die Proben in lichtdichten Flaschen in einer Kühlbox ins Labor und verarbeiten Sie sie innerhalb von 24 Stunden. Sammeln Sie Daten zu physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften des Abwassers.
  2. Assays zur Viruskonzentration
    HINWEIS: Eine sequenzielle Ultrafiltrationsmethode und eine organische Flockungsmethode, nämlich die Magermilchflockung (SMF), wurden angewendet, um die Gesamtrückgewinnungseffizienz jeder Methode unter Verwendung von gepanzerter RNA als Testvirus zu bewerten23. Andere Forscher haben Armored RNA auch als Kontrollvirus verwendet, um die Wiederherstellung von Konzentrationsmethoden für behüllte Viren zu bewerten, wie z. B. die Familie Coronaviridae22,24,25,26.
    1. Legen Sie für die Zugabe von gepanzerter RNA die Abwassertestvolumina für die Ultrafiltrations- und SMF-Methode auf 140 ml bzw. 500 ml fest. Mit einer Pipette 5 x 104 Kopien der gepanzerten RNA in sechs frische Abwasserproben, die an einem Datum entnommen wurden, und sechs frische Abwasserproben an einem anderen Datum für jede Ultrafiltrationsmethode; Ferner lagerte Spike Six (bei 4 °C) Abwasserproben, die zu einem dritten, späteren Zeitpunkt entnommen und Tage später für SMF verarbeitet wurden.
      HINWEIS: Jeder der sechs Probensätze, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten gesammelt wurden, bestand aus zwei Proben aus jeder der drei Kläranlagen. In unserer Studie wurden die ersten frischen Abwasserproben am 8. Juli 2020, die zweite am 30. September 2020 und die Abwasserproben für SMF am 14. Oktober 2020gesammelt.
    2. 30 min bei 4 °C umrühren, um die gepanzerte RNA in den Proben mit einem Magnetrührer zu beimpfen und zu homogenisieren.
    3. Entfernen Sie alle Partikel oder Zellen, die größer als 0,2 μm sind, und führen Sie eine Ultrafiltration durch.
      1. Filtrieren Sie die mit Stacheln versehenen Abwasserproben (120 ml von jeder 140 ml Spikeprobe) durch Käsetuch- und proteinarme Bindungsfilter (0,45 μm bzw. 0,2 μm, 47 mm), um große Partikel, Sedimente, Eukaryoten und Bakterien zu entfernen27. Verarbeiten Sie die gefilterten Proben mit den unten beschriebenen Ultrafiltrationsmethoden.
        HINWEIS: Die am 8.Juli und 30. September entnommenen Abwasserprobenwurden für Ultrafiltrationsmethoden mit 3.000 x g bzw. 7.500 x g verwendet.
      2. Für die sequenzielle Ultrafiltration bei 3.000 x g (UF-3k x g) werden insgesamt 120 ml der am ersten Termin bei 3.000 x g entnommenen Testprobe für 30 min konzentriert, indem 60 ml der Probe zweimal auf ca. 5 ml mit einem Zentrifugalgerät der Marke A, 30 kDa, geladen werden. Konzentrieren Sie dann das 5-ml-Volumen bei 3.000 x g für 30 Minuten mit einem Zentrifugalgerät der Marke B, 30 kDa, auf 500-1.200 μl.
      3. Ändern Sie für die sequentielle Ultrafiltration bei 7.500 x g (UF-7,5k x g) die Zentrifugationsgeschwindigkeit für das Zentrifugalgerät der Marke B von 3.000 x g auf 7.500 x g, um kleinere Endvolumina gemäß den Empfehlungen des Herstellers zu erhalten, und halten Sie die Zentrifugationsgeschwindigkeit des Zentrifugalgeräts der Marke A gleich.
        HINWEIS: Die Tests wurden mit den am 30. September entnommenen Probendurchgeführt.
    4. Führen Sie für SMF die unten beschriebenen Schritte aus.
    5. Die Abwasserproben (je 500 ml) werden mit dem SMF-Protokoll16,18 direkt konzentriert, ohne Vorfiltration mit Käsetuch und proteinarmen Membranscheibenfiltern, wie unten beschrieben, direkt konzentriert.
    6. Lösen Sie 0,5 g Magermilchpulver in 50 ml synthetischem Meerwasser auf, um eine Magermilchlösung von 1 % (w/v) zu erhalten, und stellen Sie den pH-Wert der Lösung vorsichtig mit 1 N HCl auf 3,5 ein.
      ANMERKUNG: Durch die Ansäuerung aggregieren und fallen Viren aufgrund der Änderung ihres isoelektrischen Punktes16 aus Wasser aus und verbessern die Löslichkeit von Milchpulver28.
    7. Fügen Sie 5 ml Magermilchlösung zu 500 ml Rohabwasserproben hinzu, um eine Endkonzentration der Magermilch von 0,01 % (w/v) zu erhalten.
    8. Rühren Sie die Proben 8 h bei mittlerer Geschwindigkeit und lassen Sie die gebildeten Flocken weitere 8 h bei Raumtemperatur absetzen.
    9. Entfernen Sie die Überstände vorsichtig mit serologischen Pipetten, ohne die abgesetzten Flocken zu stören. Ein Endvolumen von 50 ml mit den Flocken wird in Zentrifugenröhrchen überführt und 30 min bei 8 °C bei 8.000 x g zentrifugiert.
    10. Verschrotten Sie die Pellets vorsichtig mit einem sterilisierten Spatel und resuspendieren Sie die verbleibenden Pellets in den Röhrchen in 250 μl 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,5), nachdem der Überstand entfernt wurde. Übertragen Sie die geschabten und resuspendierten Pellets in dieselben 1,5-ml-Mini-Zentrifugenröhrchen.
  3. Führen Sie eine virale RNA-Extraktion aus viralen Konzentraten von Abwasserproben und Rückgewinnungseffizienztests mit einem RNA-Extraktionskit mit einem Verhältnis von 25:24:1 von Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol und β-Mercaptoethanol gemäß den Anweisungen des Herstellers durch, um die Extraktionseffizienz zu verbessern. Zum Schluss wird die RNA in 50 μl Elutionspuffer eluiert.
  4. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) in Echtzeit
    1. Quantifizieren Sie gepanzerte RNA mit zehnfachen Verdünnungen (7,8 x 10,4 bis 7,8 Genkopien) eines synthetischen einzelsträngigen DNA- oder gBlock-Konstrukts. In Tabelle 2 finden Sie die Primer und Sondensets, die die gepanzerte RNA nachweisen und quantifizieren.
    2. Entwerfen Sie Primer- und Sondensätze unter Verwendung des Primer-Design-Werkzeugs29 und zielen Sie auf eine 95-bp-Region (gBlock-Konstrukt) innerhalb des gepanzerten RNA-Genoms ab.
    3. Erhalten Sie Kalibrierkurven für jeden RT-qPCR-Durchlauf. Nehmen Sie Negativkontrollen in jeden qPCR-Durchlauf auf. Führen Sie Standards, Beispiele und Nicht-Vorlagen-Steuerelemente in dreifacher Ausführung aus.
    4. Bereiten Sie jede 10-μl-RT-qPCR-Mischung in der folgenden Reihenfolge vor: 2,5 μl 4x Mastermix, 400 nM von jedem Primer, 200 nM Sonde und 2,5 μl Template sowie hochreines DNAse/RNAse-freies destilliertes Wasser.
    5. Führen Sie Temperaturwechselreaktionen bei 50 °C für 5 Minuten durch, gefolgt von 45 Zyklen bei 95 °C für 10 s und 60 °C für 30 s auf einem Real-Time-PCR-System. Wenn der CT <40 betrug, betrachten Sie die Probe als gepanzerte RNA positiv.
    6. Führen Sie qPCR- und RT-qPCR-Tests mit Rinderserumalbumin mit rohen Abwasserproben durch, um die Möglichkeit von Inhibitoren oder Verunreinigungen wie Huminsäuren zu beurteilen24. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen Proben mit und ohne Enzym beobachtet.
  5. Berechnen Sie die Konzentrationen aus der Standardkurve. Berechnen Sie den Prozentsatz der Rückgewinnungseffizienz, indem Sie die zurückgewonnene Konzentration durch die Spitzenkonzentration dividieren.
  6. Transformieren Sie die Anzahl der Genkopien mit der logarithmischen10-Funktion für die Analyse. Führen Sie ein allgemeines lineares Modell mit einem statistischen Analysewerkzeug für die qPCR-Daten aus. Wenden Sie den Tukey-Test an, um Unterschiede zwischen den Methoden und Behandlungen zu erkennen. Nehmen Sie einen p-Wert von 0,05 als minimales Signifikanzniveau für den Test an.

2. Filtration und Konzentration von DNA- und RNA-Viren für die wässrige Epidemiologie

  1. Sammeln Sie für die Entnahme von Oberflächenwasser 10 l Oberflächenwasserproben und verwenden Sie 10 l deionisierte Wasserproben zur Hintergrundkontrolle. Lagern Sie alle Proben in einem 4 °C-Raum bis zur Verarbeitung innerhalb von 24 Stunden nach der Probenentnahme.
  2. Führen Sie die Aufkonzentrierung von Viren aus Umweltproben mit SMF durch, indem Sie die unten beschriebenen Schritte befolgen.
    1. Führen Sie eine Kapsel- und Vakuumfiltration mit leistungsstarken Grundwasserprobenahmekapseln und Membranscheibenfiltern mit einer Größe von 0,45 μm, 0,2 μm und 0,1 μm durch, um das Rauschen während der metagenomischen Sequenzierung zu minimieren, von größeren Fraktionen wie Mikro-Eukaryoten und Bakterien bis hin zu kleineren wie Viren.
    2. In 1,32 l synthetischem Meerwasser mit 13,2 g Magermilchpulver wird eine vorflockige Magermilchlösung von 1 Gew.-% hergestellt. Stellen Sie den pH-Wert dieser Suspension mit 1 N HCl auf 3,5 ein.
  3. Stellen Sie den pH-Wert der Oberflächenwasserproben mit 1 N HCl auf 3,5 ein.
  4. 100 ml der vorgeflockten gesäuerten Magermilchlösung werden in 10 l angesäuerte (pH 3,5) Umgebungswasserproben überführt (Endkonzentration der Magermilch von 0,01 % [w/v]).
  5. Rühren Sie die Proben mit einem Magnetrührer und einem Magnetrührstab 8 h lang bei Raumtemperatur und lassen Sie die Flocken weitere 8 h durch Schwerkraft sedimentieren. Ohne die Flocken zu stören, entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Vakuumpumpe.
  6. Die restlichen Flocken werden entsprechend dem Gewicht in 50-ml-Zentrifugenröhrchen aliquotiert und ausbalanciert und bei 8.000 x g für 30 min bei 4 °C heruntergeschleudert.
  7. Verwerfen Sie den Überstand und lösen Sie das resultierende Pellet (das theoretisch interessante Viren enthält) in 200 μl 0,2 M Natriumphosphatpuffer auf.
  8. Behandeln Sie das gelöste Pellet gemäß den Anweisungen des Herstellers mit DNase I und RNase A, um vorhandene freie DNA und RNA zu entfernen, die aufgrund des für die Nukleinsäureextraktion verwendeten Kits mitpräzipitiert werden können. Deaktivieren Sie DNase I und RNase A gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  9. Extrahieren Sie die gesamten Nukleinsäuren aus dem gelösten Pellet mit einem DNA/RNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  10. Quantifizieren Sie die Gesamtmenge der extrahierten DNA und RNA aus Abwasserproben mit einem Fluorometer. Proben mit Konzentrationen >1 ng/μL gelten als optimal für die DNA-Quantifizierung und -Sequenzierung.
  11. Führen Sie eine qPCR-Analyse durch, um auf enterische Viren von Interesse abzuzielen, und eine Hochdurchsatzsequenzierung, um die Struktur der viralen Gemeinschaft zu identifizieren.

3. Direkte Fällung und Konzentration mikrobieller Fraktionen für die wässrige Epidemiologie

  1. Entnahme von 2 l Wasserproben aus geschützten und betroffenen Gewässern. Wenn die Probe eine beträchtliche Menge an Schmutz enthält, verwenden Sie ein Käsetuch, um sie zu entfernen.
    HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, ein biologisches Duplikat pro Probe zu sammeln.
  2. Bereiten Sie eine 1%ige Magermilchlösung zu, indem Sie 4,4 g Magermilchpulver in 440 ml synthetischem Meerwasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert dieser Suspension mit 1 N HCl auf 3,5 ein.
  3. Stellen Sie den pH-Wert der Süßwasserproben mit 1 N HCl auf 3,5 ein.
  4. Zu den zuvor pH-eingestellten 2-Liter-Süßwasserproben werden 20 ml Magermilchlösung gegeben (Endkonzentration der Magermilch von 0,01 % [w/v]). Rühren Sie die Proben bei Raumtemperatur 8 h lang.
  5. Lassen Sie die Flocken weitere 8 Stunden durch die Schwerkraft sedimentieren. Entfernen Sie die Überstände vorsichtig mit einer Peristaltikpumpe. Die sedimentierten Flocken werden in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und 30 Minuten lang bei 8.000 x g heruntergeschleudert.
  6. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets mit 200 μl 0,2 M Natriumphosphatpuffer. Lagern Sie die Proben bei -20 °C oder wählen Sie ~ 0,5 g der Flocke für die mikrobielle DNA-Extraktion aus, indem Sie das Nukleinsäure-Isolationskit Ihrer Wahl gemäß den Anweisungen des Herstellers verwenden.
  7. Bestimmen Sie die DNA-Nukleinsäurekonzentration und -reinheit mit einem hochempfindlichen Fluorometer. Proben mit Konzentrationen >1 ng/μl sollten für die DNA-Quantifizierung und -Sequenzierung optimal sein.

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Representative Results

Evaluierung viraler RNA-Konzentrationsmethoden
Alle sechs Proben, die mit UF-3k x g verarbeitet wurden, waren positiv und führten zu einer Gewinnungsrate von 13,38 % ± 8,14 % (Abbildung 1). Nur eine Probe war positiv, wenn die Proben mit UF-7,5k x g bearbeitet wurden. Alle Proben, die mit SMF verarbeitet wurden, waren positiv und führten zu einer Gewinnungsrate von 15,27 % ± 2,65 % (Abbildung 1). Die durchschnittlichen Wiederfindungsraten von UF-3K x g und SMF waren signifikant und konstant (p < 0,0001) höher als UF-7,5K x g. Andererseits gab es keinen signifikanten Unterschied (p = 0,6240) zwischen den Wiederfindungsraten von UF-3K x g und SMF. Die Erhöhung der Zentrifugationsgeschwindigkeit des Zentrifugalgeräts der Marke B von 3.000 x g auf 7.500 x g führte zu einer geringeren Ausbeute, was wahrscheinlich auf die Passage von gepanzerter RNA durch Filter mit erhöhter Geschwindigkeit und die Bindung von gepanzerten RNA-Partikeln an die Filter mit erhöhter Zentrifugalgeschwindigkeit zurückzuführen ist. Die Eliminierung von Feststoffpartikeln mit Ultrafiltrationsverfahren könnte die niedrigeren Rückgewinnungsraten der Ultrafiltrationsmethoden gegenüber SMF erklären, wenn man die potenzielle Verteilung von gepanzerter RNA in die Abwasserfeststoffeberücksichtigt 30. Zusätzlich sind physikalisch-chemische und biologische Abwasserparameter (Metadaten) in Tabelle 1 zusammengefasst. Der Test von SMF mit Oberflächengewässern (Schritt 2) führte zu einer höheren Wiederfindungsrate von 42,7 % ± 15,1 %, was darauf hindeutet, dass die Aufteilung der Viren in feste Partikel die Ausbeute angesichts niedriger Feststoffkonzentrationen in Oberflächengewässern erheblich beeinflusst haben könnte.

Serielle Filtration und Aufkonzentrierung von Viren
Tabelle 3 fasst die Wasserqualitätsparameter und Nukleinsäuren zusammen, die aus Umweltwasserproben extrahiert wurden, die in Winnipeg über drei Jahreszeiten hinweg gesammelt wurden. Die DNA war an allen Probenahmeorten und über die Jahreszeiten hinweg quantifizierbar. Ergänzend Abbildung 1 zeigt eine Karte mit den Standorten der Umgebungsoberflächengewässer. Andererseits lagen die RNA-Werte meist unterhalb der Nachweisgrenze mittels Fluorometer (<0,025 ng/μL). Diese RNA-Extrakte wurden nach dem Zufallsprinzip amplifiziert, um quantifizierbare cDNA für die Hochdurchsatz-Sequenzierung zu erzeugen (Tabelle 3).

Konzentration mikrobieller Fraktionen aus Umweltwasserproben
Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen den Arbeitsablauf für die Methodik und Konzentration von mikrobiellen Fraktionen aus Oberflächenwasserproben der Umwelt. Tabelle 4 enthält die durchschnittliche DNA-Konzentration, die Standardabweichung und die Umweltbedingungen wie pH-Wert, Temperatur, gelöster Sauerstoff, atmosphärischer Druck, Niederschlag und Tageslichtzeiten der Probenahmestellen der geschützten (bewaldeten) und betroffenen (städtischen und landwirtschaftlichen) Wasserstraßen, die in dieser Studie analysiert wurden. Die Proben wurden von April 2022 bis Oktober 2022 monatlich in städtischen und ländlichen Gebieten rund um die Stadt Portage la Prairie entlang des Assiniboine River in Manitoba, Kanada, entnommen. Die höchste DNA-Konzentration wurde am Waldstandort 1 beobachtet und ergab 109,35-229,18 ng/μL. Auf der anderen Seite wurde die niedrigste mikrobielle DNA-Konzentration aus dem landwirtschaftlichen Standort 3 gewonnen und hatte eine durchschnittliche Konzentration von 19,83-22,05 ng/μl. Die durchschnittliche DNA-Konzentration, die Standardabweichung und die Metadaten aller von April bis Oktober 2022 gesammelten Proben sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Die erhaltenen DNA-Konzentrationen waren optimal für andere nachgelagerte Anwendungen, zu denen PCR, qPCR und Sequenzierung gehören (Daten nicht gezeigt).

Figure 1
Abbildung 1: Prozentuale Ausbeute und statistische Analyse für jede Methode für Abwasserproben. Abkürzungen: SMF = Magermilchflockung; UF-3K x g = Ultrafiltration bei 3.000 x g; UF-7,5K x g = Ultrafiltration bei 7.500 x g. Mittelwerte mit einem Sternchen (*) weisen auf signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen im Wert von 0,05 hin. n = 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Methodik zur Konzentration und Quantifizierung von Viren aus städtischen Gewässern in Manitoba, die Abwasser aufnehmen. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Grafische Zusammenfassung der Konzentration von Viren, Bakterien und Mikroeukaryoten für die DNA-Quantifizierung und -Sequenzierung. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Standorte von 11 Umweltwasserproben. Die Proben wurden entlang der Flüsse Red River und Assiniboine in Winnipeg (Manitoba) entnommen, wie die roten Punkte zeigen. Die drei großen Kläranlagen von Winnipeg sind als einer der besuchten Standorte blau gekennzeichnet, obwohl keine Probenahmen stattgefunden haben. Die Quellen der Daten sind Google Maps und Tableau-Software. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Tabelle 1: Wasserqualitätsparameter in Zulaufproben von NESTP, SESTP und WESTP. Abkürzungen: NESTP = North End Kläranlage; SESTP = Kläranlage am südlichen Ende; WESTP = Kläranlage West End; MLD = Millionen Liter pro Tag; TS = Gesamtfeststoffe; TSS = Schwebstoffe insgesamt; BSB5 = 5 Tage biochemischer Sauerstoffbedarf; NH4-N = Ammonium-Stickstoff; TP = Gesamtphosphor; TOC = gesamter organischer Kohlenstoff; TN = Gesamtstickstoff. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Primer-/Sonden-Sets von RT-qPCR-Assays. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Wasserqualitätsparameter der Flüsse Red und Assiniboine während der Probenentnahme im Frühjahr (16. Mai), Sommer am 27. August und Herbst (21. November 2021) und Fluorometer-Quantifizierung der Gesamtnukleinsäuren (DNA und RNA). * Die Nachweisgrenze des RNA-Kits liegt bei 0,025 ng/μl; ^ Zahlen stellen Bereichswerte dar. Abkürzungen: DO = gelöster Sauerstoff; BSB 5 =5 Tage biochemischer Sauerstoffbedarf; TP = Gesamtphosphor. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Parameter der Wasserqualität des Flusses Assiniboine während der Probenentnahme (April bis Oktober 2022). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Einer der entscheidenden Schritte in dieser Studie ist die Eliminierung von Feststoffpartikeln durch Anwendung eines Vorfiltrationsschritts mit 0,2 μm und 0,45 μm Membranfiltern. In Anbetracht der Aufteilung von Viren in feste Partikel, insbesondere behüllte Viren, kann die Vorfiltration zu einem erheblichen Verlust der Viruserholung führen30. Während bei Umwelt- und Abwasserproben fast immer ein Vorfiltrationsschritt für Ultrafiltrationsmethoden erforderlich ist, um ein Verstopfen von Ultrafiltrationsgeräten zu verhindern, kann je nach Art der nachgeschalteten Analyse eine Vorfiltration für SMF erforderlich sein. Für gezielte PCR-Studien ist eine Vorfiltration möglicherweise nicht erforderlich. Andererseits könnte die Vorfiltration die virale Metagenomik erheblich verbessern, da sie das Hintergrundrauschen in Viromen von größeren Fraktionen wie Mikroeukaryoten und Bakterien reduziert. Dieser Schritt ist entscheidend für die Sequenzierung, damit größere Genome das virale Signal nicht ausschwärmen.

Das Probenvolumen, das mit sequenzieller Ultrafiltration verarbeitet werden kann, ist auf 140 ml begrenzt. Dies ist eine wichtige Einschränkung für Proben mit niedrigen Viruszahlen. Auf der anderen Seite kann SMF viel größere Probenvolumina verarbeiten, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, Viren wiederzufinden.

Die Rückgewinnungsraten des SMF stimmen mit anderen Studien überein, die sich auf die Konzentration von Viruspartikeln aus Abwasser konzentrieren. Zuvor veröffentlichte Arbeiten berichteten von ähnlichen Genesungsraten bei einer Vielzahl von Testviren. Die berichteten durchschnittlichen Rückgewinnungsraten in diesen Studien lagen zwischen 3,4 % und 14 %13,31,32. Die vorliegende Methodik war Teil einer anderen Studie, die SARS-CoV-2 im Abwasser in Bezug auf die Fallzahlen in Winnipeg33 untersuchte. Die hier beschriebene SMF-Methode wurde in unserem Labor auch zum Screening auf SARS-CoV-2-RNA in Oxidationslagunen aus ländlichen Gemeinden von Manitoba eingesetzt. Der Nutzen der SMF-Methode wurde auch in Kombination mit der seriellen Filtration (0,45 μm, gefolgt von 0,2 μm und 0,1 μm) genutzt, um Virusgemeinschaften in Süßwasserproben aus städtischen Umgebungen mit Hilfe der Hochdurchsatzsequenzierung in unserem Labor zu charakterisieren (im zweiten Abschnitt der Methodik beschrieben). Schließlich kann die SMF-Methode auch angewendet werden, um die Ausfällung mikrobieller Gemeinschaften wie Mikroeukaryoten, Bakterien und Viren aus Wasserproben aus der Umwelt zu steuern und die weitere Charakterisierung mittels Tiefenamplikon-Sequenzierung der 18S rRNA- und 16S rRNA-Gene sowie des Hauptkapsidproteingens (g23) von Virusgruppen wie T4-ähnlichen Viren (Zambrano und Uyaguari-Díaz, unveröffentlichte Daten). Die SMF-Methode ermöglicht es, die in Wasserproben vorhandenen mikrobiellen Fraktionen von großen Eingangsvolumina (z. B. 10-40 l) auf relativ kleinere Volumina (d. h. 1-5 ml) zu konzentrieren. Im Rahmen dieser Methodik wird auch Reinstwasser als Negativ-/Hintergrundkontrolle einbezogen. Sobald die mikrobiellen Fraktionen konzentriert sind, kann die Nukleinsäureextraktion mit kommerziellen Extraktionskits oder internen Protokollen durchgeführt werden. SMF stellt eine vielseitige, relativ kostengünstige und einfach zu handhabende Methode zur Konzentration mikrobieller Fraktionen oder Viruspartikel dar, ohne signifikante Unterschiede im Vergleich zu Ultrafiltrations- oder Tangentialflussfiltrationsansätzen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit hätten beeinflussen können.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch den NSERC Alliance Covid-19 Grant (Award No. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan und Uyaguari-Díaz) unterstützt. MUD bedankt sich beim Forschungsstipendienprogramm der Universität (Auszeichnung Nr. 325201). Sowohl JF als auch JZA werden durch das Graduiertenausbildungsprogramm Visual and Automated Disease Analytics (VADA) unterstützt. KY und JF erhielten beide Stipendien aus dem Mitacs Accelerate-Programm. MUD und seine Labormitglieder (KY, JF, JZA) werden von NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) und dem Research Manitoba New Investigator Operating Grant (Nr. 5385) unterstützt. Besonderer Dank geht an die Stadt Winnipeg, Manitoba. Diese Forschung wurde an der University of Manitoba durchgeführt. Wir möchten anerkennen, dass sich der Campus der University of Manitoba auf dem ursprünglichen Land der Anishinaabeg-, Cree-, Oji-Cree-, Dakota- und Dene-Völker und auf dem Heimatland der Métis-Nation befindet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 Alfa Aesar J62041AP Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 66234 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 60043 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444432 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control Asuragen 49650 Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa Pall  OD030C65 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa Pall MCP010C46 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)  Nalgene 3119-0050PK Thermo Fisher Scientific
DNAse I Invitrogen 18047019 Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2 Invitrogen 12027 Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm Pall 12179 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution Thermo Fisher Scientific AC124210025 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit Applied biosystems A42358 Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water Promega P1197 Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump Masterflex, Cole-Parmer instrument 7553-20 Thermo Fisher Scientific
pH meter  Denver instrument RK-59503-25 Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 Invitrogen 15593031 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit Qiagen Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific A34322 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q33231 Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi Invitrogen Q33238 Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q32855 Thermo Fisher Scientific
RNAse A Invitrogen EN0531 Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit Qiagen 26000-50 Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder Difco (BD Life Sciences) DF0032173 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer Alfa Aesar Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater VWR  RC8363-1 RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4621 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4622 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol Gibco 21985023 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

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References

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Konzentration von Viruspartikeln aus Wasser- und Abwasserproben aus der Umwelt mittels Magermilchflockung und Ultrafiltration
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Yanaç, K., Francis, J., Zambrano-Alvarado, J., Yuan, Q., Uyaguari-Díaz, M. Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration. J. Vis. Exp. (193), e65058, doi:10.3791/65058 (2023).

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