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Concentrazione di particelle virali da campioni di acqua ambientale e acque reflue mediante flocculazione e ultrafiltrazione del latte scremato

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65058
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2
1Department of Civil Engineering, Price Faculty of Engineering, University of Manitoba, 2Department of Microbiology, Faculty of Science, University of Manitoba

Summary

La concentrazione di virus da campioni di acqua ambientale e acque reflue è un compito impegnativo, svolto principalmente per l'identificazione e la quantificazione dei virus. Mentre diversi metodi di concentrazione del virus sono stati sviluppati e testati, dimostriamo qui l'efficacia dell'ultrafiltrazione e della flocculazione del latte scremato per i virus a RNA con diversi tipi di campioni.

Abstract

L'epidemiologia basata sull'acqua e sulle acque reflue è emersa come metodi alternativi per monitorare e prevedere il corso delle epidemie nelle comunità. Il recupero di frazioni microbiche, inclusi virus, batteri e microeucarioti dalle acque reflue e dai campioni di acqua ambientale è uno dei passaggi impegnativi in questi approcci. In questo studio, ci siamo concentrati sull'efficienza di recupero dell'ultrafiltrazione sequenziale e dei metodi di flocculazione del latte scremato (SMF) utilizzando l'RNA corazzato come virus di prova, che viene anche utilizzato come controllo da alcuni altri studi. La prefiltrazione con filtri a disco a membrana da 0,45 μm e 0,2 μm è stata applicata per eliminare le particelle solide prima dell'ultrafiltrazione per prevenire l'intasamento dei dispositivi di ultrafiltrazione. I campioni di prova, elaborati con il metodo dell'ultrafiltrazione sequenziale, sono stati centrifugati a due diverse velocità. Una maggiore velocità ha comportato minori tassi di recupero e positività dell'RNA corazzato. D'altra parte, SMF ha portato a tassi di recupero e positività relativamente coerenti di RNA corazzato. Ulteriori test condotti con campioni di acqua ambientale hanno dimostrato l'utilità di SMF per concentrare altre frazioni microbiche. Il partizionamento dei virus in particelle solide potrebbe avere un impatto sui tassi di recupero complessivi, considerando la fase di prefiltrazione applicata prima dell'ultrafiltrazione dei campioni di acque reflue. SMF con prefiltrazione ha funzionato meglio quando applicato a campioni di acqua ambientale a causa di concentrazioni solide inferiori nei campioni e quindi tassi di ripartizione inferiori ai solidi. Nel presente studio, l'idea di utilizzare un metodo di ultrafiltrazione sequenziale è nata dalla necessità di ridurre il volume finale dei concentrati virali durante la pandemia di COVID-19, quando la fornitura dei dispositivi di ultrafiltrazione comunemente usati era limitata e vi era la necessità di sviluppare metodi alternativi di concentrazione virale.

Introduction

Determinare la concentrazione effettiva di microrganismi nei campioni di superficie e di acque reflue per l'analisi della comunità microbica e gli studi epidemiologici è uno dei passi importanti per monitorare e prevedere il decorso delle epidemie nelle comunità 1,2. La pandemia di COVID-19 ha rivelato l'importanza di migliorare i metodi di concentrazione. COVID-19 è emerso alla fine del 2019 e, a partire da marzo 2023, rappresenta ancora una minaccia per la salute umana, la vita sociale e l'economia. Strategie efficaci di sorveglianza e controllo per alleviare gli impatti delle epidemie di COVID-19 nelle comunità sono diventate un importante argomento di ricerca, poiché sono emerse nuove ondate e varianti di COVID-19 oltre alla rapida trasmissione e diffusione del virus, nonché casi asintomatici non segnalati e non diagnosticati 3,4,5. L'uso dell'epidemiologia basata sulle acque reflue per COVID-19 da parte di organizzazioni della società civile, agenzie governative e servizi pubblici o privati è stato utile per fornire rapidamente informazioni relative all'epidemia e mitigare gli impatti delle epidemie di COVID-19 6,7,8,9. Tuttavia, la concentrazione di SARS-CoV-2, un virus RNA avvolto, nei campioni di acque reflue pone ancora sfide10. Ad esempio, una di queste sfide è la ripartizione di SARS-CoV-2 nei solidi delle acque reflue, che può influire sul recupero quando i solidi vengono eliminati durante la concentrazione11. In tal caso, la quantificazione/valutazione dovrebbe concentrarsi sia sulla fase solida che su quella acquosa dei campioni di acqua ambientale, piuttosto che sulla sola fase acquosa. Inoltre, la scelta del metodo di concentrazione può essere modificata sulla base di prove e analisi a valle. La concentrazione di particelle virali e agenti patogeni da campioni ambientali è diventata un argomento di ricerca urgente con sviluppi nei campi del sequenziamento e del microbioma.

Vari metodi di concentrazione del virus sono stati applicati nel campo della concentrazione di virus da campioni di acque ambientali e acque reflue. Alcuni metodi comunemente usati sono la filtrazione, la flocculazione del latte scremato (SMF), l'adsorbimento / eluizione e la precipitazione del glicole polietilenico12-17. Tra questi, SMF è stato considerato un metodo economico ed efficace, testato con successo e applicato per il recupero di virus, tra cui SARS-CoV-2, dalle acque reflue e superficiali12,15,16,18. La procedura SMF è un approccio relativamente nuovo che ha ottenuto un maggiore riconoscimento tra molti studi ambientali come metodologia appropriata per recuperare simultaneamente una vasta gamma di microrganismi come virus, batteri e protozoi da tutti i tipi di campioni di acqua, vale a dire fanghi, acque reflue grezze, acque reflue e campioni di effluenti19. Rispetto ad altre metodologie note per recuperare virus da campioni ambientali come l'ultrafiltrazione e l'eluizione glicina-alcalina, l'approccio basato sulla liofilizzazione o l'ultracentrifugazione e l'eluizione glicina-alcalina, SMF è stato segnalato come il metodo più efficiente con tassi di recupero e rilevamento virali più elevati18,20. Nel presente studio, abbiamo utilizzato l'RNA corazzato come virus di prova per valutare l'efficienza di recupero dei metodi di concentrazione del virus, compresi i test per valutare il recupero di SARS-CoV-221,22.

Qui, abbiamo testato campioni di acque reflue e acque ambientali per dimostrare l'utilità di SMF e un metodo di ultrafiltrazione sequenziale per concentrare le frazioni microbiche per la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), la metagenomica basata sulla sequenza e il sequenziamento dell'amplicone profondo. SMF è un metodo relativamente più economico e ottimale per un volume maggiore di campioni rispetto ai metodi di ultrafiltrazione. L'idea di utilizzare un metodo di ultrafiltrazione sequenziale è nata dalla necessità di ridurre il volume finale dei concentrati virali durante la pandemia di COVID-19, quando la fornitura dei dispositivi di ultrafiltrazione comunemente usati era limitata e c'era la necessità di sviluppare metodi alternativi di concentrazione virale.

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Protocol

1. Confronto tra ultrafiltrazione seriale e flocculazione del latte scremato per concentrare virus in campioni di acque reflue

  1. Preparazione del campione
    1. Raccogliere 2 L di campioni di acque reflue grezze (influenti) composite proporzionali al flusso di 24 ore. I campioni sono stati raccolti dai tre principali impianti di trattamento delle acque reflue (WWTP) a Winnipeg, in Canada, durante l'estate e l'autunno del 2020 (Tabella 1).
    2. Trasportare i campioni in laboratorio in flaconi a prova di luce in una ghiacciaia e lavorarli entro 24 ore. Raccogliere dati sulle caratteristiche fisico-chimiche e biologiche delle acque reflue.
  2. Saggi della concentrazione del virus
    NOTA: Un metodo di ultrafiltrazione sequenziale e un metodo di flocculazione organica, vale a dire la flocculazione del latte scremato (SMF), sono stati applicati per valutare l'efficienza di recupero totale di ciascun metodo utilizzando l'RNA corazzato come virus di prova23. Altri ricercatori hanno anche usato l'RNA corazzato come virus di controllo per valutare il recupero dei metodi di concentrazione per i virus avvolti, come la famiglia Coronaviridae22,24,25,26.
    1. Per l'aggiunta di RNA corazzato, impostare i volumi di test delle acque reflue per i metodi di ultrafiltrazione e SMF rispettivamente a 140 ml e 500 ml. Utilizzando un pipettatore, aggiungere 5 x 104 copie di RNA corazzato in sei campioni di acque reflue fresche raccolti in una data e sei campioni di acque reflue fresche in un'altra data, per ciascun metodo di ultrafiltrazione; inoltre, il picco sei ha immagazzinato (a 4 °C) campioni di acque reflue raccolti in una terza data successiva e trattati giorni dopo per SMF.
      NOTA: Ciascuno dei sei set di campioni raccolti in date diverse era composto da due campioni di ciascuno dei tre WWTP. Nel nostro studio, la prima serie di campioni di acque reflue fresche sono stati raccolti l'8 luglio 2020, la seconda il 30 settembre 2020 e i campioni di acque reflue da conservare per SMF il 14 ottobre 2020.
    2. Agitare per 30 minuti a 4 °C per inoculare e omogeneizzare l'RNA corazzato nei campioni utilizzando un agitatore magnetico.
    3. Rimuovere tutte le particelle o le cellule più grandi di 0,2 μm ed eseguire l'ultrafiltrazione.
      1. Filtrare i campioni di acque reflue a spillo (120 ml da ciascun campione a spillo da 140 ml) attraverso garza e filtri a disco a membrana da 0,45 μm e 0,2 μm, da 47 mm, rispettivamente, per rimuovere particelle di grandi dimensioni, sedimenti, eucarioti e batteri27. Elaborare i campioni filtrati utilizzando i metodi di ultrafiltrazione descritti di seguito.
        NOTA: I campioni di acque reflue raccoltil'8 luglio e il 30 settembresono stati utilizzati per metodi di ultrafiltrazione con 3.000 x g e 7.500 x g, rispettivamente.
      2. Per l'ultrafiltrazione sequenziale a 3.000 x g (UF-3k x g), concentrare un totale di 120 ml del campione di prova raccolto alla prima data a 3.000 x g per 30 minuti caricando 60 ml del campione due volte a circa 5 ml utilizzando un dispositivo centrifugo di marca A, 30 kDa. Quindi, concentrare il volume di 5 ml a 3.000 x g per 30 minuti utilizzando un dispositivo centrifugo di marca B, 30 kDa, a 500-1.200 μL.
      3. Per l'ultrafiltrazione sequenziale a 7.500 x g (UF-7,5k x g), modificare la velocità di centrifugazione per il dispositivo centrifugo di marca B da 3.000 x g a 7.500 x g per ottenere volumi finali più piccoli, secondo le raccomandazioni del produttore, e mantenere la stessa velocità di centrifugazione del dispositivo centrifugo di marca A.
        NOTA: I test sono stati eseguiti con i campioni raccolti il 30settembre.
    4. Per SMF, eseguire i passaggi descritti di seguito.
    5. Puntare i campioni di acque reflue (500 ml ciascuno) per concentrarsi direttamente utilizzando il protocollo SMF16,18, senza prefiltrazione con garza e filtri a disco a membrana legante a basso contenuto proteico, come descritto di seguito.
    6. Sciogliere 0,5 g di latte scremato in polvere in 50 mL di acqua di mare sintetica per ottenere una soluzione di latte scremato all'1% (p/v) e regolare attentamente il pH della soluzione a 3,5 utilizzando 1 N HCl.
      NOTA: L'acidificazione fa sì che i virus si aggreghino e precipitano fuori dall'acqua a causa del cambiamento nel loro punto isoelettrico16 e migliora la solubilità del latte in polvere28.
    7. Aggiungere 5 mL di soluzione di latte scremato a 500 mL di campioni di acque reflue grezze per ottenere una concentrazione finale di latte scremato dello 0,01% (p/v).
    8. Mescolare i campioni per 8 ore a velocità media e lasciare che i fiocchi formati si depositino per altre 8 ore a temperatura ambiente.
    9. Rimuovere accuratamente i surnatanti utilizzando pipette sierologiche senza disturbare i fiocchi depositati. Trasferire un volume finale di 50 mL contenente i fiocchi in provette da centrifuga e centrifugare a 8.000 x g per 30 minuti a 8 °C.
    10. Rottamare accuratamente i pellet utilizzando una spatola sterilizzata e risospendere i pellet rimanenti nei tubi in 250 μL di tampone fosfato di sodio 0,2 M (pH 7,5) dopo aver rimosso il surnatante Trasferire i pellet raschiati e risospesi nelle stesse provette da mini-centrifuga da 1,5 ml.
  3. Eseguire l'estrazione dell'RNA virale da concentrati virali di campioni di acque reflue e saggi di efficienza di recupero utilizzando un kit di estrazione dell'RNA con un rapporto 25: 24: 1 di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico e β-mercaptoetanolo, secondo le istruzioni del produttore, per migliorare l'efficienza di estrazione. Infine, eluire l'RNA in 50 μL di tampone di eluizione.
  4. Analisi della reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)
    1. Quantificare l'RNA corazzato utilizzando diluizioni decuplicate (7,8 x 10da 4 a 7,8 copie del gene) di un DNA sintetico a singolo filamento o di un costrutto gBlock. Vedere la Tabella 2 per i primer e i set di sonde che rilevano e quantificano l'RNA corazzato.
    2. Progetta set di primer e sonde utilizzando lo strumento di progettazione del primer29 e mira a una regione di 95 bp (costrutto gBlock) all'interno del genoma dell'RNA corazzato.
    3. Ottenere curve di calibrazione per ogni esecuzione RT-qPCR. Includere controlli negativi in ogni esecuzione di qPCR. Eseguire standard, esempi e controlli non modello in triplice copia.
    4. Preparare ogni miscela RT-qPCR da 10 μL nel seguente ordine: 2,5 μL di miscela master 4x, 400 nM di ciascun primer, sonda da 200 nM e 2,5 μL di modello, nonché acqua distillata ultrapura priva di DNAse/RNAsi.
    5. Eseguire reazioni di cicli termici a 50 °C per 5 minuti, seguiti da 45 cicli di 95 °C per 10 s e 60 °C per 30 s su un sistema di PCR in tempo reale. Se la TC era <40, considerare il campione di RNA corazzato positivo.
    6. Condurre test qPCR e RT-qPCR utilizzando albumina sierica bovina con campioni di acque reflue grezze per valutare la possibilità di inibitori o contaminanti come gli acidi umici24. Non sono state osservate differenze significative tra campioni con e senza l'enzima.
  5. Calcolare le concentrazioni dalla curva standard. Calcolare la percentuale di efficienza di recupero dividendo la concentrazione recuperata per la concentrazione di spike.
  6. Trasformare i numeri di copie del gene utilizzando la funzione log10 per l'analisi. Eseguire un modello lineare generale utilizzando uno strumento di analisi statistica sui dati qPCR. Applicare il test di Tukey per rilevare le differenze tra i metodi e trattamenti. Prendi un valore p di 0,05 come livello minimo di significatività per il test.

2. Filtrazione e concentrazione di virus a DNA e RNA per l'epidemiologia a base acquosa

  1. Per la raccolta di acque superficiali ambientali, raccogliere 10 L di campioni di acque superficiali ambientali e utilizzare 10 L di campioni di acqua deionizzata per il controllo di fondo. Conservare tutti i campioni in una stanza a 4 °C fino alla lavorazione entro 24 ore dalla raccolta dei campioni.
  2. Eseguire la concentrazione di virus da campioni ambientali con SMF utilizzando i passaggi descritti di seguito.
    1. Eseguire la filtrazione in capsule e sotto vuoto utilizzando capsule di campionamento delle acque sotterranee ad alta capacità e filtri a disco a membrana di dimensioni di 0,45 μm, 0,2 μm e 0,1 μm per ridurre al minimo il rumore durante il sequenziamento metagenomico, da frazioni più grandi come microeucarioti e batteri a quelle più piccole come i virus.
    2. Preparare una soluzione di latte scremato preflocculata all'1% in peso per volume in 1,32 L di acqua di mare sintetica con 13,2 g di latte scremato in polvere. Regolare il pH di questa sospensione a 3,5 utilizzando 1 N HCl.
  3. Regolare il pH dei campioni di acque superficiali ambientali a 3,5 utilizzando 1 N HCl.
  4. Trasferire 100 mL della soluzione di latte scremato acidificato preflocculata in 10 L di campioni di acqua ambientale acidificata (pH 3,5) (concentrazione finale di latte scremato dello 0,01% [p/v]).
  5. Utilizzando un agitatore magnetico e un agitatore magnetico, agitare i campioni per 8 ore a temperatura ambiente e lasciare sedimentare i fiocchi per gravità per altre 8 ore. Senza disturbare i fiocchi, rimuovere con cura il surnatante usando una pompa per vuoto.
  6. Aliquot e bilanciare i fiocchi rimanenti in base al peso in provette da centrifuga da 50 mL e farli girare a 8.000 x g per 30 minuti a 4 °C.
  7. Scartare il surnatante e sciogliere il pellet risultante (che teoricamente contiene virus di interesse) in 200 μL di tampone fosfato di sodio 0,2 M.
  8. Trattare il pellet disciolto con DNasi I e RNasi A, seguendo le istruzioni del produttore, per eliminare il DNA libero e l'RNA presenti che possono essere co-precipitati grazie al kit utilizzato per l'estrazione dell'acido nucleico. Disattivare la DNasi I e la RNasi A seguendo le istruzioni del produttore.
  9. Estrarre gli acidi nucleici totali dal pellet disciolto utilizzando un kit di estrazione del DNA / RNA, secondo le istruzioni del produttore.
  10. Quantificare la quantità totale di DNA e RNA estratti da campioni di effluenti utilizzando un fluorometro. I campioni con concentrazioni >1 ng/μL sono considerati ottimali per la quantificazione e il sequenziamento del DNA.
  11. Eseguire analisi qPCR per colpire i virus enterici di interesse e sequenziamento ad alto rendimento per identificare la struttura della comunità virale.

3. Precipitazione diretta e concentrazione di frazioni microbiche per l'epidemiologia acquosa

  1. Raccogliere 2 litri di campioni d'acqua da corsi d'acqua protetti e impattati. Se il campione contiene una notevole quantità di detriti, utilizzare una garza per rimuoverli.
    NOTA: Si consiglia vivamente di raccogliere un duplicato biologico per campione.
  2. Preparare una soluzione di latte scremato all'1% (p/v) sciogliendo 4,4 g di latte scremato in polvere in 440 ml di acqua di mare sintetica. Regolare il pH di questa sospensione a 3,5 con 1 N HCl.
  3. Regolare il pH dei campioni di acqua dolce a 3,5 utilizzando 1 N HCl.
  4. Aggiungere 20 ml di soluzione di latte scremato ai campioni di acqua dolce da 2 litri precedentemente regolati per il pH (concentrazione finale di latte scremato dello 0,01% [p/v]). Mescolare i campioni a temperatura ambiente per 8 ore.
  5. Lasciare sedimentare i fiocchi per gravità per altre 8 ore. Rimuovere con cura i surnatanti con una pompa peristaltica. Trasferire i fiocchi sedimentati in una provetta da centrifuga da 50 ml e farli girare a 8.000 x g per 30 minuti.
  6. Scartare il surnatante e risospendere i pellet con 200 μL di tampone fosfato di sodio 0,2 M. Conservare i campioni a -20 °C o procedere alla selezione di ~ 0,5 g del fiocco per l'estrazione del DNA microbico utilizzando il kit di isolamento degli acidi nucleici scelto, seguendo le istruzioni del produttore.
  7. Determinare la concentrazione e la purezza dell'acido nucleico del DNA con un fluorometro ad alta sensibilità. I campioni con concentrazioni >1 ng/μL dovrebbero essere ottimali per la quantificazione e il sequenziamento del DNA.

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Representative Results

Valutazione dei metodi di concentrazione dell'RNA virale
Tutti e sei i campioni trattati con UF-3k x g sono risultati positivi e hanno determinato un recupero del 13,38% ± dell'8,14% (Figura 1). Solo un campione è risultato positivo quando i campioni sono stati elaborati con UF-7.5k x g. Tutti i campioni trattati con SMF sono risultati positivi e hanno determinato un recupero del 15,27% ± del 2,65% (Figura 1). I tassi medi di recupero di UF-3K x g e SMF erano significativamente e costantemente (p < 0,0001) superiori a UF-7,5K x g. D'altra parte, non vi era alcuna differenza significativa (p = 0,6240) tra i tassi di recupero di UF-3K x g e SMF. L'aumento della velocità di centrifugazione del dispositivo centrifugo di marca B a 7.500 x g da 3.000 x g ha comportato un recupero inferiore, probabilmente a causa del passaggio dell'RNA corazzato attraverso i filtri ad una velocità aumentata e del legame delle particelle di RNA corazzato sui filtri ad una maggiore velocità centrifuga. L'eliminazione delle particelle solide con metodi di ultrafiltrazione potrebbe spiegare i tassi di recupero più bassi dei metodi di ultrafiltrazione contro SMF, considerando il potenziale partizionamento dell'RNA corazzato ai solidi delle acque reflue30. Inoltre, i parametri fisico-chimici e biologici delle acque reflue (metadati) sono riassunti nella Tabella 1. Il test SMF con acque superficiali (fase 2) ha portato a un tasso di recupero più elevato, 42,7% ± 15,1%, indicando che la suddivisione dei virus in particelle solide potrebbe aver influenzato significativamente il recupero considerando basse concentrazioni solide nelle acque superficiali.

Filtrazione seriale e concentrazione di virus
La tabella 3 riassume i parametri di qualità dell'acqua e gli acidi nucleici estratti dai campioni di acqua ambientale raccolti all'interno di Winnipeg in tre stagioni. Il DNA era quantificabile in tutti i luoghi di campionamento e in tutte le stagioni. La figura supplementare 1 indica una mappa con le posizioni ambientali delle acque superficiali. D'altra parte, i valori di RNA erano per lo più al di sotto del limite di rilevazione utilizzando un fluorometro (<0,025 ng / μL). Questi estratti di RNA sono stati amplificati casualmente per generare cDNA quantificabile per il sequenziamento ad alto rendimento (Tabella 3).

Concentrazione di frazioni microbiche da campioni di acqua ambientale
Le figure 2 e 3 illustrano il flusso di lavoro per la metodologia e la concentrazione di frazioni microbiche da campioni ambientali di acque superficiali. La tabella 4 contiene la concentrazione media di DNA, la deviazione standard e le condizioni ambientali, come pH, temperatura, ossigeno disciolto, pressione atmosferica, precipitazioni e ore diurne dei siti di campionamento dei corsi d'acqua protetti (boschi) e impattati (urbani e agricoli) analizzati in questa ricerca. I campioni sono stati raccolti mensilmente da aprile 2022 a ottobre 2022 nelle aree urbane e rurali che circondano la città di Portage la Prairie lungo il fiume Assiniboine a Manitoba, in Canada. La più alta concentrazione di DNA è stata osservata nel sito forestale 1 e ha prodotto 109,35-229,18 ng / μL. D'altra parte, la più bassa concentrazione di DNA microbico è stata recuperata dal sito agricolo 3 e aveva una concentrazione media di 19,83-22,05 ng / μL. La concentrazione media di DNA, la deviazione standard e i metadati di tutti i campioni raccolti da aprile a ottobre 2022 sono riassunti nella Tabella 4. Le concentrazioni di DNA ottenute erano ottimali per altre applicazioni a valle, che includono PCR, qPCR e sequenziamento (dati non mostrati).

Figure 1
Figura 1: Recupero percentuale e analisi statistica per ciascun metodo per i campioni di acque reflue. Abbreviazioni: SMF = flocculazione del latte scremato; UF-3K x g = ultrafiltrazione a 3.000 x g; UF-7.5K x g = ultrafiltrazione a 7.500 x g. Le medie con un asterisco (*) indicano differenze significative al livello 0,05 tra i trattamenti; n = 6. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Rappresentazione schematica della metodologia utilizzata per concentrare e quantificare i virus provenienti dai corpi idrici urbani del Manitoba che ricevono effluenti di acque reflue. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Estratto grafico della concentrazione di virus, batteri e microeucarioti per la quantificazione e il sequenziamento del DNA. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1: Ubicazione di 11 campioni di acqua ambientale. I campioni sono stati raccolti lungo i fiumi Red e Assiniboine a Winnipeg, Manitoba, come indicato dai punti rossi. I tre principali impianti di trattamento delle acque reflue di Winnipeg sono indicati in blu come uno dei siti visitati, anche se non si sono verificati eventi di campionamento. Le fonti dei dati sono Google Maps e il software Tableau. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella 1: Parametri di qualità dell'acqua nei campioni influenti di NESTP, SESTP e WESTP. Abbreviazioni: NESTP = North End Sewage Treatment Plant; SESTP = South End Sewage Treatment Plant; WESTP = West End Sewage Treatment Plant; MLD = milioni di litri al giorno; TS = solidi totali; TSS = solidi sospesi totali; BOD5 = domanda biochimica di ossigeno a 5 giorni; NH4-N = azoto ammonico; TP = fosforo totale; TOC = carbonio organico totale; TN = azoto totale. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Set di primer/sonde dei saggi RT-qPCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Parametri di qualità dell'acqua dei fiumi Rossi e Assiniboine durante la raccolta dei campioni in primavera il 16 maggio, estate il 27 agosto e autunno il 21 novembre 2021) e quantificazione fluorometrica degli acidi nucleici totali (DNA e RNA). * Il limite di rilevazione del kit RNA è 0,025 ng/μL; ^ I numeri rappresentano i valori dell'intervallo. Abbreviazioni: DO = ossigeno disciolto; BOD 5 =5 giorni di domanda biochimica di ossigeno; TP = fosforo totale. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4: Parametri di qualità dell'acqua del fiume Assiniboine durante la raccolta dei campioni (da aprile a ottobre 2022). Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Uno dei passaggi critici in questo studio è l'eliminazione delle particelle solide applicando una fase di prefiltrazione con filtri a membrana da 0,2 μm e 0,45 μm. Considerando il partizionamento dei virus in particelle solide, in particolare i virus avvolti, la prefiltrazione può causare una perdita significativa nel recupero virale30. Mentre una fase di prefiltrazione per i metodi di ultrafiltrazione è quasi sempre necessaria per i campioni ambientali e di acque reflue per prevenire l'intasamento dei dispositivi di ultrafiltrazione, potrebbe essere necessaria la prefiltrazione per SMF a seconda del tipo di analisi a valle. Per studi PCR mirati, la prefiltrazione potrebbe non essere necessaria. D'altra parte, la prefiltrazione potrebbe migliorare significativamente la metagenomica virale, poiché riduce il rumore di fondo nei viromes da frazioni più grandi come microeucarioti e batteri. Questo passaggio è fondamentale per il sequenziamento in modo che genomi più grandi non sciamano il segnale virale.

Il volume di campione che può essere elaborato con l'ultrafiltrazione sequenziale è limitato a 140 ml. Questa è una limitazione importante per i campioni con un basso numero di virus. D'altra parte, SMF può elaborare volumi di campioni molto più grandi, aumentando la probabilità di recuperare virus.

I tassi di recupero dell'SMF sono in accordo con altri studi incentrati sulla concentrazione di particelle virali dalle acque reflue. Articoli pubblicati in precedenza hanno riportato tassi di recupero simili con una varietà di virus di prova. I tassi medi di recupero riportati in questi studi variavano tra il 3,4% e il 14%13,31,32. La presente metodologia faceva parte di un altro studio che indagava SARS-CoV-2 nelle acque reflue in relazione al numero di casi a Winnipeg33. Il metodo SMF qui descritto è stato utilizzato anche per lo screening dell'RNA SARS-CoV-2 nelle lagune di ossidazione delle comunità rurali di Manitoba nel nostro laboratorio. L'utilità del metodo SMF è stata utilizzata anche in combinazione con la filtrazione seriale (0,45 μm seguita da 0,2 μm e 0,1 μm) per caratterizzare le comunità virali in campioni di acqua dolce provenienti da ambienti urbani utilizzando il sequenziamento ad alta produttività nel nostro laboratorio (descritto nella seconda sezione della metodologia). Infine, il metodo SMF può anche essere applicato per dirigere la precipitazione di comunità microbiche, come microeucarioti, batteri e virus da campioni di acqua ambientale, e un'ulteriore caratterizzazione utilizzando il sequenziamento dell'amplicone profondo dei geni rRNA 18S e rRNA 16S, nonché il principale gene della proteina del capside (g23) di gruppi virali come i virus T4-like (Zambrano e Uyaguari-Díaz, dati non pubblicati). Il metodo SMF consente di concentrare le frazioni microbiche presenti nei campioni d'acqua da grandi volumi di input (cioè 10-40 L) a volumi relativamente più piccoli (cioè 1-5 ml). Come parte di questa metodologia, l'acqua ultrapura è inclusa anche come controllo negativo / di fondo. Una volta che le frazioni microbiche sono concentrate verso il basso, l'estrazione dell'acido nucleico può essere condotta utilizzando kit di estrazione commerciali o protocolli interni. SMF rappresenta un metodo versatile, relativamente economico e facile per concentrare frazioni microbiche o particelle virali, senza differenze significative rispetto agli approcci di ultrafiltrazione o filtrazione a flusso tangenziale.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che potrebbero aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da NSERC Alliance Covid-19 Grant (Premio n. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan e Uyaguari-Díaz). MUD desidera ringraziare il programma di borse di ricerca universitarie (premio n. 325201). Sia JF che JZA sono supportati dal programma di formazione per laureati Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY e JF hanno entrambi ricevuto borse di studio dal programma Mitacs Accelerate. MUD e i suoi membri del laboratorio (KY, JF, JZA) sono supportati da NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) e dalla sovvenzione Research Manitoba New Investigator Operating (No 5385). Un ringraziamento speciale alla città di Winnipeg, Manitoba. Questa ricerca è stata condotta presso l'Università di Manitoba. Vorremmo riconoscere che i campus dell'Università di Manitoba si trovano sulle terre originali dei popoli Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota e Dene e sulla patria della nazione Métis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 Alfa Aesar J62041AP Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 66234 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 60043 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444432 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control Asuragen 49650 Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa Pall  OD030C65 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa Pall MCP010C46 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)  Nalgene 3119-0050PK Thermo Fisher Scientific
DNAse I Invitrogen 18047019 Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2 Invitrogen 12027 Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm Pall 12179 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution Thermo Fisher Scientific AC124210025 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit Applied biosystems A42358 Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water Promega P1197 Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump Masterflex, Cole-Parmer instrument 7553-20 Thermo Fisher Scientific
pH meter  Denver instrument RK-59503-25 Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 Invitrogen 15593031 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit Qiagen Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific A34322 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q33231 Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi Invitrogen Q33238 Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q32855 Thermo Fisher Scientific
RNAse A Invitrogen EN0531 Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit Qiagen 26000-50 Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder Difco (BD Life Sciences) DF0032173 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer Alfa Aesar Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater VWR  RC8363-1 RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4621 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4622 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol Gibco 21985023 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

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References

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Yanaç, K., Francis, J., Zambrano-Alvarado, J., Yuan, Q., Uyaguari-Díaz, M. Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration. J. Vis. Exp. (193), e65058, doi:10.3791/65058 (2023).

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