Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Koncentration af viruspartikler fra miljøvands- og spildevandsprøver ved hjælp af skummetmælksflokkulering og ultrafiltrering

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65058
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2
1Department of Civil Engineering, Price Faculty of Engineering, University of Manitoba, 2Department of Microbiology, Faculty of Science, University of Manitoba

Summary

Viruskoncentration fra vand- og spildevandsprøver fra omgivelserne er en udfordrende opgave, der primært udføres til identifikation og kvantificering af vira. Mens flere viruskoncentrationsmetoder er blevet udviklet og testet, demonstrerer vi her effektiviteten af ultrafiltrering og skummetmælksflokkulering for RNA-vira med forskellige prøvetyper.

Abstract

Vand- og spildevandsbaseret epidemiologi er opstået som alternative metoder til at overvåge og forudsige udbrudsforløbet i samfund. Genvinding af mikrobielle fraktioner, herunder vira, bakterier og mikroeukaryoter fra spildevand og miljøvandprøver, er et af de udfordrende trin i disse tilgange. I denne undersøgelse fokuserede vi på genopretningseffektiviteten af sekventiel ultrafiltrering og skummetmælksflokkuleringsmetoder (SMF) ved hjælp af pansret RNA som testvirus, som også bruges som kontrol af nogle andre undersøgelser. Forfiltrering med 0,45 μm og 0,2 μm membranskivefiltre blev anvendt for at eliminere faste partikler før ultrafiltrering for at forhindre tilstopning af ultrafiltreringsanordninger. Testprøver, behandlet med den sekventielle ultrafiltreringsmetode, blev centrifugeret med to forskellige hastigheder. En øget hastighed resulterede i lavere restitution og positivitetsrater for pansret RNA. På den anden side resulterede SMF i relativt konsistente genopretnings- og positivitetshastigheder for pansret RNA. Yderligere tests udført med miljømæssige vandprøver viste nytten af SMF til at koncentrere andre mikrobielle fraktioner. Opdeling af vira i faste partikler kan have indflydelse på de samlede genvindingshastigheder i betragtning af det forfiltreringstrin, der anvendes før ultrafiltrering af spildevandsprøver. SMF med forfiltrering klarede sig bedre, når den blev anvendt på miljømæssige vandprøver på grund af lavere faste koncentrationer i prøverne og dermed lavere opdelingshastigheder til faste stoffer. I denne undersøgelse opstod ideen om at anvende en sekventiel ultrafiltreringsmetode fra nødvendigheden af at reducere det endelige volumen af de virale koncentrater under COVID-19-pandemien, da udbuddet af de almindeligt anvendte ultrafiltreringsanordninger var begrænset, og der var behov for udvikling af alternative virale koncentrationsmetoder.

Introduction

Bestemmelse af den effektive koncentration af mikroorganismer i overflade- og spildevandsprøver til mikrobiel samfundsanalyse og epidemiologiske undersøgelser er et af de vigtige skridt til overvågning og forudsigelse af udbrudsforløbet i samfund 1,2. COVID-19-pandemien udfoldede vigtigheden af at forbedre koncentrationsmetoderne. COVID-19 opstod i slutningen af 2019 og udgør fra marts 2023 stadig en trussel mod menneskers sundhed, det sociale liv og økonomien. Effektive overvågnings- og kontrolstrategier til at afbøde virkningerne af COVID-19-udbrud i samfund er blevet et vigtigt forskningsemne, da nye bølger og varianter af COVID-19 er dukket op ud over den hurtige transmission og spredning af virussen samt urapporterede og udiagnosticerede asymptomatiske tilfælde 3,4,5. Brugen af spildevandsbaseret epidemiologi for COVID-19 af civilsamfundsorganisationer, offentlige myndigheder og offentlige eller private forsyningsselskaber har været nyttig til at give hurtig udbrudsrelateret information og afbøde virkningerne af COVID-19-udbrud 6,7,8,9. Koncentrationen af SARS-CoV-2, en indhyllet RNA-virus, i spildevandsprøver udgør dog stadig udfordringer10. For eksempel er en af disse udfordringer opdelingen af SARS-CoV-2 i spildevandsfaste stoffer, hvilket kan påvirke genvindingen, når de faste stoffer elimineres under koncentration11. Hvis dette er tilfældet, bør kvantificeringen/vurderingen fokusere på både faste og vandige faser af vandprøver fra miljøet og ikke kun på den vandige fase. Desuden kan valget af koncentrationsmetode ændres på grundlag af downstream-test og analyser. Koncentrationen af viruspartikler og patogener fra miljøprøver er blevet et presserende forskningsemne med udvikling inden for sekventering og mikrobiomfelter.

Forskellige viruskoncentrationsmetoder er blevet anvendt inden for viruskoncentration fra miljøvand- og spildevandsprøver. Nogle almindeligt anvendte metoder er filtrering, skummetmælksflokkulering (SMF), adsorption / eluering og polyethylenglycoludfældning12-17. Blandt dem er SMF blevet betragtet som en billig og effektiv metode, testet med succes og anvendt til at genvinde vira, herunder SARS-CoV-2, fra spildevand og overfladevand12,15,16,18. SMF-proceduren er en relativt ny tilgang, der har vundet øget anerkendelse blandt mange miljøundersøgelser som en passende metode til samtidig at genvinde en bred vifte af mikroorganismer såsom vira, bakterier og protozoer fra alle typer vandprøver, nemlig slam, rå spildevand, spildevand og spildevandsprøver19. Sammenlignet med andre kendte metoder til at genvinde vira fra miljøprøver såsom ultrafiltrering og glycin-alkalisk eluering, frysetørringsbaseret tilgang eller ultracentrifugering og glycin-alkalisk eluering, er SMF blevet rapporteret som den mest effektive metode med højere viral genvinding og detektionshastigheder18,20. I denne undersøgelse brugte vi pansret RNA som en testvirus til at vurdere genopretningseffektiviteten af viruskoncentrationsmetoder, herunder test til vurdering af SARS-CoV-2-genopretning21,22.

Her testede vi spildevands- og miljøvandprøver for at demonstrere nytten af SMF og en sekventiel ultrafiltreringsmetode til at koncentrere mikrobielle fraktioner til kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR), sekvensbaseret metagenomik og dybampliconsokventering. SMF er en relativt billigere metode og optimal til en større mængde prøver sammenlignet med ultrafiltreringsmetoder. Ideen om at anvende en sekventiel ultrafiltreringsmetode opstod fra nødvendigheden af at reducere det endelige volumen af de virale koncentrater under COVID-19-pandemien, da udbuddet af de almindeligt anvendte ultrafiltreringsanordninger var begrænset, og der var behov for udvikling af alternative virale koncentrationsmetoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sammenligning af seriel ultrafiltrering og skummetmælksflokkulering for at koncentrere vira i spildevandsprøver

  1. Forberedelse af prøver
    1. Der indsamles 2 L 24 timers flowproportionale sammensatte rå(tilløbs) spildevandsprøver. Der blev indsamlet prøver fra de tre store spildevandsrensningsanlæg i Winnipeg, Canada, i løbet af sommeren og efteråret 2020 (tabel 1).
    2. Transporter prøverne til laboratoriet i lystætte flasker i en isboks og behandl dem inden for 24 timer. Indsamle data om fysisk-kemiske og biologiske egenskaber for spildevand.
  2. Viruskoncentrationsassays
    BEMÆRK: En sekventiel ultrafiltreringsmetode og en organisk flokkuleringsmetode, nemlig skummetmælksflokkulering (SMF), blev anvendt til at vurdere den samlede genvindingseffektivitet af hver metode ved anvendelse af pansret RNA som testvirus23. Andre forskere har også brugt pansret RNA som en kontrolvirus til vurdering af genopretning af koncentrationsmetoder for indhyllede vira, såsom familien Coronaviridae22,24,25,26.
    1. For tilsætning af pansret RNA indstilles spildevandstestvolumenerne for ultrafiltrerings- og SMF-metoderne til henholdsvis 140 ml og 500 ml. Ved hjælp af en pipetter spikes 5 x 104 kopier af pansret RNA til seks friske spildevandsprøver indsamlet på en dato og seks friske spildevandsprøver på en anden dato for hver ultrafiltreringsmetode; Endvidere spike seks lagrede (ved 4 °C) spildevandsprøver indsamlet på en tredje, senere dato og behandlet dage senere for SMF.
      BEMÆRK: Hvert af de seks prøvesæt, der blev indsamlet på forskellige datoer, bestod af to prøver fra hver af de tre renseanlæg. I vores undersøgelse blev det første sæt ferskvandsprøver indsamlet den 8. juli 2020, det andet den 30. september 2020, og spildevandsprøverne skulle opbevares til SMF den 14. oktober 2020.
    2. Der omrøres i 30 minutter ved 4 °C for at inokulere og homogenisere det pansrede RNA i prøverne ved hjælp af en magnetisk omrører.
    3. Fjern alle partikler eller celler større end 0,2 μm og udfør ultrafiltrering.
      1. Filtrer de spikede spildevandsprøver (120 ml fra hver 140 ml spiked prøve) gennem osteklæde og lavproteinbinding, henholdsvis 0,45 μm og 0,2 μm, 47 mm membranskivefiltre for at fjerne store partikler, sedimenter, eukaryoter og bakterier27. Behandl de filtrerede prøver ved hjælp af de ultrafiltreringsmetoder, der er beskrevet nedenfor.
        BEMÆRK: De spildevandsprøver, der blev indsamlet den 8. juli og 30. september, blev brugt til ultrafiltreringsmetoder med henholdsvis 3.000 xg og 7.500 x g.
      2. Til sekventiel ultrafiltrering ved 3.000 x g (UF-3k x g) koncentreres i alt 120 ml af den testprøve, der blev indsamlet på den første dato, ved 3.000 x g i 30 minutter ved at fylde 60 ml af prøven to gange til ca. 5 ml ved hjælp af en centrifugalanordning af mærke A, 30 kDa. Koncentrer derefter 5 ml volumen ned ved 3.000 x g i 30 minutter ved hjælp af en mærke B centrifugalanordning, 30 kDa, til 500-1.200 μL.
      3. For sekventiel ultrafiltrering ved 7,500 x g (UF-7.5k x g) skal du ændre centrifugeringshastigheden for mærke B-centrifugalanordningen fra 3,000 x g til 7,500 x g for at opnå mindre slutvolumener i henhold til producentens anbefalinger og holde centrifugeringshastigheden for mærke A-centrifugalindretningen den samme.
        BEMÆRK: Testene blev kørt med prøverne indsamlet den 30.september.
    4. For SMF skal du udføre nedenstående trin.
    5. Spike spildevandsprøverne (500 ml hver) for at koncentrere dem direkte ved hjælp af SMF-protokollen16,18 uden forfiltrering med osteklæde og lavproteinbindende membranskivefiltre, som beskrevet nedenfor.
    6. 0,5 g skummetmælkspulver opløses i 50 ml syntetisk havvand for at opnå en 1% (w/v) skummetmælksopløsning, og opløsningens pH-værdi justeres omhyggeligt til 3,5 ved hjælp af 1 N HCl.
      BEMÆRK: Forsuring får vira til at samle sig og udfældes ud af vand på grund af ændringen i deres isoelektriske punkt16 og forbedrer opløseligheden af mælkepulver28.
    7. Tilsæt 5 ml skummetmælksopløsning til 500 ml rå spildevandsprøver for at opnå en slutkoncentration af skummetmælk på 0,01% (w/v).
    8. Prøverne omrøres i 8 timer ved medium hastighed, og de dannede flokke afregnes i yderligere 8 timer ved stuetemperatur.
    9. Supernatanterne fjernes forsigtigt med serologiske pipetter uden at forstyrre bundfældningerne. Et slutvolumen på 50 ml indeholdende flokkene overføres til centrifugeglas og centrifugeres ved 8.000 x g i 30 minutter ved 8 °C.
    10. Pellets skrottes forsigtigt med en steriliseret spatel, og de resterende pellets i glassene resuspenderes i 250 μL 0,2 M natriumphosphatbuffer (pH 7,5), efter at supernatanten er fjernet. Overfør de skrabede og resuspenderede pellets til de samme 1,5 ml minicentrifugerør.
  3. Udfør viral RNA-ekstraktion fra virale koncentrater af spildevandsprøver og genvindingseffektivitetsassays ved hjælp af et RNA-ekstraktionssæt med et forhold på 25: 24: 1 phenol: chloroform: isoamylalkohol og β-mercaptoethanol i henhold til producentens anvisninger for at forbedre ekstraktionseffektiviteten. Endelig elueres RNA'et i 50 μL elueringsbuffer.
  4. Analyse af realtidskvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR)
    1. Kvantificer pansret RNA ved hjælp af ti gange fortyndinger (7,8 x 10,4 til 7,8 genkopier) af en syntetisk enkeltstrenget DNA- eller gBlock-konstruktion. Se tabel 2 for primere og sondesæt, der detekterer og kvantificerer det pansrede RNA.
    2. Design primer- og sondesæt ved hjælp af primerdesignværktøjet29 og målret mod en 95 bp-region (gBlock-konstruktion) inden for det pansrede RNA-genom.
    3. Få kalibreringskurver for hver RT-qPCR-kørsel. Medtag negative kontroller i hver qPCR-kørsel. Kør standarder, eksempler og kontrolelementer, der ikke er skabeloner, i tre eksemplarer.
    4. Forbered hver 10 μL RT-qPCR-blanding i følgende rækkefølge: 2,5 μL 4x masterblanding, 400 nM af hver primer, 200 nM-sonde og 2,5 μL skabelon samt ultrarent DNAse/RNAse-frit destilleret vand.
    5. Udfør termiske cykelreaktioner ved 50 °C i 5 minutter efterfulgt af 45 cyklusser med 95 °C i 10 sekunder og 60 °C i 30 sekunder på et PCR-system i realtid. Hvis CT var <40, skal du overveje prøven pansret RNA positiv.
    6. Udfør qPCR- og RT-qPCR-test ved hjælp af bovint serumalbumin med rå spildevandsprøver for at vurdere muligheden for inhibitorer eller forurenende stoffer såsom humic syrer24. Der blev ikke observeret signifikante forskelle mellem prøver med og uden enzymet.
  5. Beregn koncentrationerne ud fra standardkurven. Beregn genvindingseffektivitetsprocenten ved at dividere den genvundne koncentration med den øgede koncentration.
  6. Transformér genkopinumre ved hjælp af log10-funktionen til analyse. Kør en generel lineær model ved hjælp af et statistisk analyseværktøj på qPCR-dataene. Anvend Tukeys test for at opdage forskelle mellem metoder og behandlinger. Tag en p-værdi på 0,05 for at være et minimumssignifikansniveau for testen.

2. Filtrering og koncentration af DNA- og RNA-vira til vandbaseret epidemiologi

  1. Til opsamling af overfladevand i miljøet indsamles 10 liter overfladevandprøver fra omgivelserne, og der anvendes 10 L deioniserede vandprøver til baggrundskontrol. Alle prøverne opbevares i et lokale til 4 °C, indtil de behandles senest 24 timer efter prøveindsamlingen.
  2. Udfør koncentration af vira fra miljøprøver med SMF ved hjælp af nedenstående trin.
    1. Udfør kapsel- og vakuumfiltrering ved hjælp af grundvandsprøvetagningskapsler med høj kapacitet og membranskivefiltre på 0,45 μm, 0,2 μm og 0,1 μm størrelser for at minimere støj under metagenomisk sekventering, fra større fraktioner såsom mikro-eukaryoter og bakterier til mindre såsom vira.
    2. Forbered en 1 vægtprocent forflokkuleret skummetmælksopløsning i 1,32 l syntetisk havvand med 13,2 g skummetmælkspulver. Denne suspensions pH-værdi justeres til 3,5 ved hjælp af 1 N HCl.
  3. pH-værdien i overfladevandprøverne i omgivelserne justeres til 3,5 ved hjælp af 1 N HCl.
  4. 100 ml af den præflokkulerede syrnede skummetmælksopløsning overføres til 10 l syrnede (pH 3,5) vandprøver fra omgivelserne (slutkoncentration af skummetmælk på 0,01 % [w/v]).
  5. Ved hjælp af en magnetisk omrører og en magnetisk omrøringsstang omrøres prøverne i 8 timer ved stuetemperatur, og flokkene sedimenteres ved tyngdekraften i yderligere 8 timer. Uden at forstyrre flokkene fjernes supernatanten forsigtigt ved hjælp af en vakuumpumpe.
  6. De resterende flokke afstemmes efter vægten i 50 ml centrifugeglas og centrifugeres ned ved 8.000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
  7. Supernatanten kasseres, og den resulterende pellet (som teoretisk indeholder relevante vira) opløses i 200 μL 0,2 M natriumphosphatbuffer.
  8. Det opløste pellet behandles med DNase I og RNase A efter producentens anvisninger for at eliminere frit DNA og RNA til stede, der kan udfældes samtidig på grund af det sæt, der anvendes til nukleinsyreekstraktion. Deaktiver DNase I og RNase A ved at følge producentens anvisninger.
  9. Uddrag samlede nukleinsyrer fra det opløste pellet ved hjælp af et DNA / RNA-ekstraktionssæt i henhold til producentens anvisninger.
  10. Kvantificer den samlede mængde ekstraheret DNA og RNA fra spildevandsprøver ved hjælp af et fluorometer. Prøver med koncentrationer >1 ng/μL anses for optimale til DNA-kvantificering og sekventering.
  11. Udfør qPCR-analyse for at målrette mod enteriske vira af interesse og high-throughput sekventering for at identificere den virale samfundsstruktur.

3. Direkte udfældning og koncentration af mikrobielle fraktioner til vandbaseret epidemiologi

  1. Der indsamles 2 L vandprøver fra beskyttede og påvirkede vandløb. Hvis prøven indeholder en betydelig mængde affald, skal du bruge en ostekloth til at fjerne dem.
    BEMÆRK: Det anbefales stærkt at indsamle en biologisk duplikater pr. prøve.
  2. Forbered en 1% (w/v) skummetmælksopløsning ved at opløse 4,4 g skummetmælkspulver i 440 ml syntetisk havvand. Denne suspensions pH-værdi justeres til 3,5 med 1 N HCI.
  3. Ferskvandsprøvernes pH-værdi justeres til 3,5 ved hjælp af 1 N HCl.
  4. Der tilsættes 20 ml skummetmælksopløsning til de tidligere pH-justerede 2 L ferskvandsprøver (endelig skummetmælkskoncentration på 0,01% [w/v]). Prøverne omrøres ved stuetemperatur i 8 timer.
  5. Lad flokkene sedimentere ved tyngdekraften i yderligere 8 timer. Supernatanterne fjernes forsigtigt med en peristaltisk pumpe. Overfør sedimentflokkene til et 50 ml centrifugerør og drej dem ned ved 8.000 x g i 30 minutter.
  6. Supernatanten kasseres, og pellets resuspenderes med 200 μL 0,2 M natriumphosphatbuffer. Prøverne opbevares ved -20 °C, eller der vælges ~ 0,5 g af flokken til mikrobiel DNA-ekstraktion ved hjælp af det valgte nukleinsyreisolationssæt efter producentens anvisninger.
  7. Bestem DNA-nukleinsyrekoncentrationen og renheden med et fluorometer med høj følsomhed. Prøver med koncentrationer >1 ng/μL bør være optimale til DNA-kvantificering og sekventering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Evaluering af virale RNA-koncentrationsmetoder
Alle seks prøver behandlet med UF-3k x g var positive og resulterede i en 13,38% ± 8,14% genopretning (figur 1). Kun én prøve var positiv, da prøverne blev behandlet med UF-7.5k x g. Alle prøver behandlet med SMF var positive og resulterede i en 15,27% ± 2,65% genopretning (figur 1). De gennemsnitlige genvindingshastigheder for UF-3K x g og SMF var signifikant og konsekvent (p < 0,0001) højere end UF-7.5K x g. På den anden side var der ingen signifikant forskel (p = 0, 6240) mellem genvindingshastighederne for UF-3K x g og SMF. Forøgelse af centrifugeringshastigheden for mærke B-centrifugalindretningen til 7.500 x g fra 3.000 x g resulterede i lavere genopretning, sandsynligvis på grund af passage af pansret RNA gennem filtre med en øget hastighed og binding af pansrede RNA-partikler på filtrene ved en øget centrifugalhastighed. Eliminering af faste partikler med ultrafiltreringsmetoder kan forklare de lavere genvindingshastigheder for ultrafiltreringsmetoderne mod SMF i betragtning af den potentielle opdeling af pansret RNA til spildevandsfaste stoffer30. Derudover er fysisk-kemiske og biologiske spildevandsparametre (metadata) opsummeret i tabel 1. Test af SMF med overfladevand (trin 2) resulterede i en højere genvindingsgrad, 42,7% ± 15,1%, hvilket indikerer, at opdeling af vira i faste partikler kan have påvirket genvindingen betydeligt i betragtning af lave faste koncentrationer i overfladevand.

Seriel filtrering og koncentration af vira
Tabel 3 opsummerer vandkvalitetsparametrene og nukleinsyrer ekstraheret fra miljømæssige vandprøver indsamlet i Winnipeg over tre sæsoner. DNA var kvantificerbart på alle prøvetagningssteder og på tværs af årstider. Supplerende figur 1 viser et kort med overfladevandets placeringer. På den anden side RNA-værdierne var for det meste under detektionsgrænsen ved hjælp af et fluorometer (<0,025 ng / μL). Disse RNA-ekstrakter blev tilfældigt amplificeret for at generere kvantificerbart cDNA til high-throughput sekventering (tabel 3).

Koncentration af mikrobielle fraktioner fra vandprøver fra omgivelserne
Figur 2 og figur 3 viser arbejdsgangen for metoden og koncentrationen af mikrobielle fraktioner fra overfladevandsprøver i miljøet. Tabel 4 indeholder den gennemsnitlige DNA-koncentration, standardafvigelse og miljøforholdene, såsom pH, temperatur, opløst ilt, atmosfærisk tryk, nedbør og dagslys for prøveudtagningsstederne for de beskyttede (skovklædte) og påvirkede (by- og landbrugs) vandveje, der er analyseret i denne forskning. Prøver blev indsamlet månedligt fra april 2022 til oktober 2022 i by- og landområder omkring byen Portage la Prairie langs Assiniboine-floden i Manitoba, Canada. Den højeste DNA-koncentration blev observeret i skovområdet 1 og gav 109,35-229,18 ng/μL. På den anden side blev den laveste mikrobielle DNA-koncentration genfundet fra landbrugsstedet 3 og havde en gennemsnitlig koncentration på 19,83-22,05 ng/μL. Den gennemsnitlige DNA-koncentration, standardafvigelse og metadata for alle prøver indsamlet fra april til oktober 2022 er opsummeret i tabel 4. De opnåede DNA-koncentrationer var optimale til andre downstream-applikationer, som inkluderer PCR, qPCR og sekventering (data ikke vist).

Figure 1
Figur 1: Procentvis genvinding og statistisk analyse for hver metode for spildevandsprøver. Forkortelser: SMF = skummetmælksfukulering; UF-3K x g = ultrafiltrering ved 3.000 x g; UF-7.5K x g = ultrafiltrering ved 7.500 x g. Midler med en stjerne (*) angiver signifikante forskelle på 0,05-niveauet på tværs af behandlinger; n = 6. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skematisk gengivelse af den metode, der anvendes til at koncentrere og kvantificere vira fra byområder i Manitoba, der modtager spildevand. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Grafisk abstrakt af koncentrationen af vira, bakterier og mikroeukaryoter til DNA-kvantificering og sekventering. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Placering af 11 vandprøver fra miljøet. Prøver blev indsamlet langs floderne Red og Assiniboine i Winnipeg, Manitoba, som angivet med de røde prikker. Winnipegs tre store rensningsanlæg er angivet med blåt som et af de besøgte steder, selv om der ikke forekom nogen prøvetagning. Kilderne til dataene er Google maps og Tableau-software. Klik her for at downloade denne fil.

Tabel 1: Vandkvalitetsparametre i tilløbsprøver af NESTP, SESTP og WESTP. Forkortelser: NESTP = North End spildevandsrensningsanlæg; SESTP = South End spildevandsrensningsanlæg; WESTP = rensningsanlæg i West End MLD = millioner liter om dagen; TS = samlede faste stoffer; TSS = samlet indhold af suspenderet stof BOD5 = 5 dages biokemisk iltbehov; NH4-N = ammoniumkvælstof; TP = total fosfor; TOC = samlet organisk kulstof TN = total kvælstof. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Primer-/sondesæt af RT-qPCR-assays. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Røde og assiniboine floder vandkvalitetsparametre under prøveindsamling i foråret den 16. maj, sommeren den 27. august og efteråret den 21. november 2021) og fluorometerkvantificering af samlede nukleinsyrer (DNA og RNA). * Detektionsgrænsen for RNA-sættet er 0,025 ng/μL; ^ Tal repræsenterer intervalværdier. Forkortelser: DO = opløst ilt; BOD5= 5 dages biokemisk iltbehov; TP = fosfor i alt. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Parametre for vandkvaliteten i Assiniboine-floden under prøveindsamlingen (april til oktober 2022). Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et af de kritiske trin i denne undersøgelse er eliminering af faste partikler ved at anvende et forfiltreringstrin med 0,2 μm og 0,45 μm membranfiltre. I betragtning af opdelingen af vira i faste partikler, især indhyllede vira, kan præfiltrering forårsage et betydeligt tab i viral genopretning30. Mens et forfiltreringstrin for ultrafiltreringsmetoder næsten altid er nødvendigt for miljø- og spildevandsprøver for at forhindre ultrafiltreringsenheder i at tilstoppe, kan forfiltrering for SMF være påkrævet afhængigt af typen af nedstrømsanalyse. For målrettede PCR-undersøgelser er forfiltrering muligvis ikke påkrævet. På den anden side kan præfiltrering forbedre viral metagenomik betydeligt, da det reducerer baggrundsstøj i viromer fra større fraktioner såsom mikroeukaryoter og bakterier. Dette trin er afgørende for sekventering, så større genomer ikke sværmer det virale signal.

Prøvevolumenet, der kan behandles med sekventiel ultrafiltrering, er begrænset til 140 ml. Dette er en vigtig begrænsning for prøver med lave virustal. På den anden side kan SMF behandle meget større prøvevolumener, hvilket øger sandsynligheden for at genvinde vira.

SMF's genvindingsprocenter stemmer overens med andre undersøgelser, der fokuserer på koncentrationen af virale partikler fra spildevand. Tidligere offentliggjorte papirer rapporterede lignende genopretningshastigheder med en række testvira. De rapporterede gennemsnitlige helbredelsesrater i disse undersøgelser varierede mellem 3,4% og 14%13,31,32. Den nuværende metode var en del af en anden undersøgelse, der undersøgte SARS-CoV-2 i spildevand i forhold til sagsnumre i Winnipeg33. SMF-metoden beskrevet her er også blevet brugt til at screene for SARS-CoV-2 RNA i oxidationslaguner fra landdistrikterne i Manitoba i vores laboratorium. SMF-metodens anvendelighed er også blevet anvendt i kombination med seriel filtrering (0,45 μm efterfulgt af 0,2 μm og 0,1 μm) til at karakterisere virale samfund i ferskvandsprøver fra bymiljøer ved hjælp af high-throughput sekventering i vores laboratorium (beskrevet i andet afsnit af metoden). Endelig kan SMF-metoden også anvendes til at styre udfældningen af mikrobielle samfund, såsom mikroeukaryoter, bakterier og vira fra miljømæssige vandprøver og yderligere karakterisering ved hjælp af dyb ampliconsekventering af 18S rRNA- og 16S rRNA-generne samt det store capsidproteingen (g23) af virale grupper såsom T4-lignende vira (Zambrano og Uyaguari-Díaz, ikke-offentliggjorte data). SMF-metoden gør det muligt at koncentrere de mikrobielle fraktioner, der er til stede i vandprøver, fra store inputvolumener (dvs. 10-40 L) til relativt mindre volumener (dvs. 1-5 ml). Som en del af denne metode er ultrarent vand også inkluderet som en negativ / baggrundskontrol. Når de mikrobielle fraktioner er koncentreret ned, kan nukleinsyreekstraktion udføres ved hjælp af kommercielle ekstraktionssæt eller interne protokoller. SMF repræsenterer en alsidig, relativt billig og nem / hands-off metode til at koncentrere mikrobielle fraktioner eller virale partikler uden signifikante forskelle sammenlignet med ultrafiltrering eller tangentiel flowfiltreringsmetoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen kendte konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold, der kunne have syntes at påvirke det arbejde, der er rapporteret i dette papir.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NSERC Alliance Covid-19 Grant (pris nr. 431401363, 2020-2021, Dr. Yuan og Uyaguari-Díaz). MUD vil gerne takke University Research Grants Program (Award No. 325201). Både JF og JZA understøttes af Visual and Automated Disease Analytics (VADA) kandidatuddannelsesprogram. KY og JF modtog begge stipendier fra Mitacs Accelerate-programmet. MUD og hans laboratoriemedlemmer (KY, JF, JZA) støttes af NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) og Research Manitoba New Investigator Operating grant (nr. 5385). Særlig tak til byen Winnipeg, Manitoba. Denne forskning blev udført ved University of Manitoba. Vi vil gerne anerkende, at University of Manitoba campusser er placeret på de oprindelige lande Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota og Dene folk og på hjemlandet for Métis Nation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 Alfa Aesar J62041AP Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 66234 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 60043 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444432 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control Asuragen 49650 Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa Pall  OD030C65 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa Pall MCP010C46 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)  Nalgene 3119-0050PK Thermo Fisher Scientific
DNAse I Invitrogen 18047019 Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2 Invitrogen 12027 Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm Pall 12179 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution Thermo Fisher Scientific AC124210025 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit Applied biosystems A42358 Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water Promega P1197 Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump Masterflex, Cole-Parmer instrument 7553-20 Thermo Fisher Scientific
pH meter  Denver instrument RK-59503-25 Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 Invitrogen 15593031 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit Qiagen Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific A34322 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q33231 Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi Invitrogen Q33238 Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q32855 Thermo Fisher Scientific
RNAse A Invitrogen EN0531 Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit Qiagen 26000-50 Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder Difco (BD Life Sciences) DF0032173 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer Alfa Aesar Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater VWR  RC8363-1 RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4621 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4622 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol Gibco 21985023 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
  2. Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
  3. Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
  4. Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
  5. Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
  6. Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
  7. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  8. Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
  9. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
  10. Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
  11. Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
  12. Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
  13. Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
  14. Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
  15. Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
  16. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  17. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
  18. Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
  20. Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
  21. Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
  22. Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
  23. Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
  24. Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
  25. Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
  26. Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
  27. Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
  28. Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), Geneious. https://www.geneious.com. 3526-3537 (2018).
  29. Geneious. , Available from: https://www.geneious.com (2021).
  30. Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
  31. Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
  32. Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
  33. Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 193
Koncentration af viruspartikler fra miljøvands- og spildevandsprøver ved hjælp af skummetmælksflokkulering og ultrafiltrering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yanaç, K., Francis, J.,… More

Yanaç, K., Francis, J., Zambrano-Alvarado, J., Yuan, Q., Uyaguari-Díaz, M. Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration. J. Vis. Exp. (193), e65058, doi:10.3791/65058 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter