Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65314
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

Summary

Die Kontraktilität von Actomyosin spielt eine wichtige Rolle bei der Zell- und Gewebemorphogenese. Es ist jedoch schwierig, die Actomyosin-Kontraktilität in vivo akut zu manipulieren. Dieses Protokoll beschreibt ein optogenetisches System, das die Rho1-vermittelte Actomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen schnell hemmt und den sofortigen Verlust der Epithelspannung nach der Inaktivierung von Actomyosin in vivo aufdeckt.

Abstract

Kontraktile Kräfte, die durch Aktin und Nicht-Muskelmyosin II erzeugt werden ("Actomyosin-Kontraktilität"), sind entscheidend für morphologische Veränderungen von Zellen und Geweben auf mehreren Längenskalen, wie z. B. Zellteilung, Zellmigration, Epithelfaltung und verzweigte Morphogenese. Ein tiefgreifendes Verständnis der Rolle der Aktomyosin-Kontraktilität in der Morphogenese erfordert Ansätze, die eine schnelle Inaktivierung von Actomyosin ermöglichen, die mit herkömmlichen genetischen oder pharmakologischen Ansätzen nur schwer zu erreichen ist. Das vorgestellte Protokoll demonstriert die Verwendung eines CRY2-CIBN-basierten optogenetischen Dimerisierungssystems, Opto-Rho1DN, zur Hemmung der Aktomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen mit präzisen zeitlichen und räumlichen Kontrollen. In diesem System ist CRY2 mit der dominanten negativen Form von Rho1 (Rho1DN) fusioniert, während CIBN an der Plasmamembran verankert ist. Die Blaulicht-vermittelte Dimerisierung von CRY2 und CIBN führt zu einer schnellen Translokation von Rho1DN aus dem Zytoplasma in die Plasmamembran, wo es Actomyosin durch Hemmung von endogenem Rho1 inaktiviert. Darüber hinaus wird in diesem Artikel ein detailliertes Protokoll für die Kopplung der Opto-Rho1DN-vermittelten Inaktivierung von Aktomyosin mit der Laserablation vorgestellt, um die Rolle von Actomyosin bei der Erzeugung von Epithelspannung während der ventralen Furchenbildung von Drosophila zu untersuchen. Dieses Protokoll kann auf viele andere morphologische Prozesse angewendet werden, die die Aktomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen mit minimalen Modifikationen beinhalten. Insgesamt ist dieses optogenetische Werkzeug ein leistungsfähiger Ansatz, um die Funktion der Actomyosin-Kontraktilität bei der Kontrolle der Gewebemechanik während des dynamischen Gewebeumbaus zu untersuchen.

Introduction

Die Actomyosin-Kontraktilität, die kontraktile Kraft, die von Nicht-Muskel-Myosin II (im Folgenden "Myosin") auf das F-Aktin-Netzwerk ausgeübt wird, ist eine der wichtigsten Kräfte bei der Veränderung der Zellform und der Steuerung der Morphogenese auf Gewebeebene 1,2. Zum Beispiel führt die Aktivierung der Actomyosin-Kontraktilität an der apikalen Domäne der Epithelzellen zu einer apikalen Verengung, die eine Vielzahl morphogenetischer Prozesse erleichtert, darunter Epithelfaltung, Zellextrusion, Delamination und Wundheilung 3,4,5,6,7 . Die Aktivierung von Myosin erfordert die Phosphorylierung seiner regulatorischen Leichtkette. Diese Modifikation mildert die hemmende Konformation der Myosinmoleküle, so dass sie bipolare Myosinfilamentbündel mit mehreren Kopfdomänen an beiden Enden bilden können. Die bipolaren Myosinfilamente treiben die antiparallele Bewegung der Aktinfilamente an und führen zur Erzeugung der Kontraktionskraft 1,8,9.

Die evolutionär konservierte kleine GTPase RhoA (Rho1 in Drosophila) spielt eine zentrale Rolle bei der Aktivierung der Aktomyosin-Kontraktilität in verschiedenen zellulären Kontexten10,11. Rho1 fungiert als bimolekularer Schalter, indem es entweder GTP (aktive Form) oder GDP (inaktive Form) bindet12. Der Kreislauf zwischen GTP- oder GDP-gebundenem Rho1 wird durch seine GTPase-aktivierenden Proteine (GAPs) und Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) reguliert13. GEFs erleichtern den Austausch von BIP gegen GTP und aktivieren so die Rho1-Aktivität. GAPs hingegen verstärken die GTPase-Aktivität von Rho1 und deaktivieren so Rho1. Aktiviertes Rho1 fördert die Kontraktilität von Aktomyosin, indem es mit seinen nachgeschalteten Effektoren, der Rho-assoziierten Kinase (Rok) und Diaphanous14, interagiert und diese aktiviert. Rok induziert die Myosinaktivierung und die Aktomyosinkontraktilität durch Phosphorylierung der regulatorischen leichten Kette von Myosin15. Darüber hinaus hemmt Rok auch die Myosin-regulatorische Leichtkettenphosphatase und fördert somit die Myosin-Filament-Assemblierung16 weiter. Rok kann auch LIM-Kinasen phosphorylieren, die, wenn sie aktiviert werden, den Aktinabbau verhindern, indem sie den Aktin-Depolymerisationsfaktor Cofilin17,18 phosphorylieren und hemmen. Diaphanous ist ein Aktinnukleator der Forminfamilie, der die Aktinpolymerisation fördert und eine Basis für die Interaktion von Myosin mit 19,20,21 bietet.

Während die zellulären Mechanismen, die die Kontraktilität von Actomyosin aktivieren, gut aufgeklärt sind, ist unser Verständnis seiner Funktion bei der Regulierung des dynamischen Gewebeumbaus noch unvollständig. Um diese Wissenslücke zu schließen, sind Ansätze erforderlich, die Actomyosin an bestimmten Geweberegionen in vivo schnell inaktivieren und die unmittelbaren Auswirkungen auf das Verhalten und die Eigenschaften des Gewebes aufzeichnen können. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines optogenetischen Ansatzes zur akuten Hemmung der Aktomyosin-Kontraktilität während der Einstülpung des Drosophila-Mesoderms, gefolgt von der Messung der Epithelspannung mittels Laserablation. Während der Gastrulation von Drosophila erleiden die ventral lokalisierten Mesoderm-Vorläuferzellen eine apikale Verengung und invaginatieren von der Oberfläche des Embryos, indem sie eine anterior-posterior orientierte Furche bilden22,23. Die Bildung ventraler Furchen dient seit langem als Modell für die Untersuchung des Mechanismus der Epithelfaltung. Die Bildung der ventralen Furchen wird durch das dorsal-ventrale Mustersystem in Drosophila 24,25,26,27 gesteuert. Die Expression von zwei Transkriptionsfaktoren, Twist und Snail, die sich auf der ventralen Seite des Embryos befinden, steuert die ventrale Furchenbildung und spezifiziert das Schicksal der mesodermalen Zellen28. Twist und Snail aktivieren die Rekrutierung des Rho1 GEF RhoGEF2 an die Spitze der Mesoderm-Vorläuferzellen über einen G-Protein-gekoppelten Rezeptorweg und ein RhoGEF2-Adapterprotein, T48 29,30,31,32,33. Als nächstes aktiviert RhoGEF2 Myosin auf der gesamten apikalen Oberfläche des potenziellen Mesoderms über den Rho-Rho-Kinase-Signalweg 34,35,36,37,38,39. Aktiviertes Myosin bildet ein suprazelluläres Actomyosin-Netzwerk auf der gesamten apikalen Oberfläche des Mesoderm-Primordiums, dessen Kontraktionen die apikale Verengung vorantreiben und zu einem schnellen Anstieg der apikalen Gewebespannung führen 14,37,40.

Das in diesem Protokoll beschriebene optogenetische Werkzeug, Opto-Rho1DN, hemmt die Kontraktilität von Actomyosin durch Blaulicht-abhängige Plasmamembranrekrutierung einer dominanten negativen Form von Rho1 (Rho1DN)41. Eine T19N-Mutation in Rho1DN eliminiert die Fähigkeit des mutierten Proteins, GDP gegen GTP auszutauschen, und macht das Protein somit dauerhaft inaktiv34. Eine nachfolgende Mutation in Rho1DN, C189Y, eliminiert dessen naives Membran-Targeting-Signal42,43. Wenn Rho1DN in die Plasmamembran infundiert wird, bindet es an Rho1-GEFs und staut sie, wodurch die Aktivierung von Rho1 sowie die Rho1-vermittelte Aktivierung von Myosin und Aktin blockiertwerden 34,44. Die Rekrutierung von Rho1DN in der Plasmamembran erfolgt durch ein lichtabhängiges Dimerisierungsmodul, das von Cryptochrom 2 und seinem Bindungspartner CIB1 abgeleitet ist. Cryptochrom 2 ist ein durch blaues Licht aktivierter Cryptochrom-Photorezeptor in Arabidopsis thaliana45. Cryptochrom 2 bindet nur im photoangeregten Zustand an CIB1, ein basisches Helix-Schleifen-Helix-Protein45. Später wurde festgestellt, dass die konservierte N-terminale Photolyase-Homologie-Region (PHR) von Cryptochrom 2 (CRY2PHR, im Folgenden als CRY2 bezeichnet) und die N-terminale Domäne (aa 1-170) von CIB1 (im Folgenden CIBN) für die lichtinduzierte Dimerisierung wichtig sind46. Opto-Rho1DN besteht aus zwei Komponenten. Die erste Komponente ist das CIBN-Protein, das mit einem CAAX-Anker fusioniert ist, der das Protein an der Plasmamembran47 lokalisiert. Die zweite Komponente ist mCherry-markiertes CRY2, das mit Rho1DN41 fusioniert ist. In Abwesenheit von blauem Licht verbleibt CRY2-Rho1DN im Zytoplasma. Nach Stimulation durch blaues Licht wird CRY2-Rho1DN durch die Wechselwirkung zwischen membranverankertem CIBN und angeregtem CRY2 auf die Plasmamembran gerichtet. Opto-Rho1DN kann durch ultraviolettes A-Licht (UVA) und blaues Licht (400-500 nm, maximale Aktivierung bei 450-488 nm) oder durch einen gepulsten Laser mit 830-980 nm aktiviert werden, wenn eine Zwei-Photonen-Stimulation durchgeführtwird 41,46,47,48. Daher wird Opto-Rho1DN durch Wellenlängen stimuliert, die normalerweise für die Anregung von GFP verwendet werden (488 nm für die Einzelphotonen-Bildgebung und 920 nm für die Zwei-Photonen-Bildgebung). Im Gegensatz dazu stimulieren Wellenlängen, die üblicherweise für die Anregung von mCherry verwendet werden (561 nm für die Einzelphotonen-Bildgebung und 1.040 nm für die Zwei-Photonen-Bildgebung), das optogenetische Modul nicht und können daher für die Bildgebung vor der Stimulation verwendet werden. Das Protokoll beschreibt die Ansätze, die verwendet werden, um das Risiko einer unerwünschten Stimulation während der Probenmanipulation zu minimieren.

Die Laserablation wurde in großem Umfang eingesetzt, um Spannungen in Zellen und Geweben zu erkennen und zu messen49. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Zwei-Photonen-Laserablation unter Verwendung eines Femtosekunden-Nahinfrarotlasers bei entsprechender Kontrolle der Laserintensität einige subzelluläre Strukturen (z. B. kortikale Actomyosin-Netzwerke) physikalisch beeinträchtigen kann, ohne eine Plasmamembran-Raptur zu verursachen50,51. Wenn das Gewebe unter Spannung steht, führt die Laserablation einer interessierenden Region innerhalb des Gewebes zu einem sofortigen Rückstoß der an die abgetragene Region angrenzenden Zellen nach außen. Die Rückstoßgeschwindigkeit ist eine Funktion der Größe der Spannung und der Viskosität des Mediums (Zytoplasma), das die Strukturen umgibt, die dem Rückstoß ausgesetzt sind49. Aufgrund der überlegenen Eindringtiefe der Nahinfrarotlaser und der Möglichkeit, eine gut begrenzte fokale Ablation zu erreichen, ist die Zwei-Photonen-Laserablation besonders nützlich für die Erkennung von Gewebespannungen in vivo. Wie in diesem Protokoll gezeigt, kann diese Methode leicht mit der Opto-Rho1DN-vermittelten Inaktivierung der Actomyosin-Kontraktilität kombiniert werden, um den direkten Einfluss der Rho1-abhängigen zellulären Kontraktilität auf die Gewebemechanik während des dynamischen Gewebeumbaus zu untersuchen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Aufstellen der genetischen Kreuzung und Vorbereiten des Eizellentnahmebechers

  1. Ausgewählte weibliche Fliegen (jungfräulich) aus der optogenetischen Linie UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) auf einem CO2 -Pad unter einem Stereomikroskop und eine Kreuzung mit männlichen Fliegen aus der mütterlichen GAL4-Treiberlinie 67 Sqh-mCherry; 15 E-Cadherin-GFP.
    ANMERKUNG: Die 67 und 15 stehen für maternales Tubulin-GAL4, das in das zweite (II) bzw. dritte (III) Chromosom eingefügt ist,52. Die in diesem Protokoll verwendete GAL4-Linie exprimiert auch die mCherry-markierte regulatorische Myosin-Leichtkette Sqh (Spaghettikürbis)37 und GFP-markiertes E-Cadherin53. Fliegen aus der optogenetischen Linie können noch FM7- und TM6-Balancer-Chromosomen enthalten. Fliegen aus der mütterlichen GAL4-Treiberlinie können noch die CyO- und TM3-Balancer-Chromosomen enthalten.
  2. Wählen Sie nach ~10 Tagen weibliche F1-Fliegen mit folgendem Genotyp aus: UASp-CIBNpm/+; 67 qm Kirsche/+; 15 E-Cadherin-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry. Stellen Sie einen Eiersammelbecher mit den männlichen Fliegen auf.
    1. Stellen Sie sicher, dass die weiblichen Fliegen mit dem richtigen Genotyp keine Balancer-Chromosomen enthalten (d. h. sie sollten keine gelockten Flügel [Cy], kurze Borsten [Sb], balken- oder nierenförmige Augen [B] oder extrahumerale Borsten [Hu] enthalten), die Marker für die CyO-, TM3-, FM7- und TM6-Balancer sind, die bei der Erzeugung der Stämme verwendet werden. Decken Sie die Tasse mit einem Apfelsaftteller ab, auf dessen Oberfläche ein Hauch frischer Hefepaste liegt.
      HINWEIS: Bei F1-Weibchen werden die optogenetischen Komponenten mütterlich exprimiert. Daher müssen die F1-Weibchen, die für die Einrichtung des Bechers verwendet werden, keine Jungfrauen sein. Es wird empfohlen, männliche Fliegen aus der gleichen F1-Population für den Becher zu verwenden.
  3. Bewahren Sie den Becher in einem mit Aluminiumfolie bedeckten Karton auf, um ein mögliches Austreten von Licht aus der Umgebung zu vermeiden. Wechseln Sie die Apfelsaftplatte jeden Tag für Tassen, die bei Raumtemperatur (~21-23 °C) aufbewahrt werden, oder alle zwei Tage für Tassen, die bei 18 °C aufbewahrt werden.
    1. Klopfen Sie den Becher unmittelbar vor dem Tellerwechsel auf eine ebene Fläche (z. B. Tischplatte), um die Fliegen am Boden des Bechers zu halten und zu verhindern, dass sie entweichen. Wechseln Sie den Apfelsaftteller in einem dunklen Raum und verwenden Sie eine Stirnlampe mit rotem Licht zur Beleuchtung (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Um die Expression der Konstrukte zu erhöhen, die unter der Kontrolle von maternalem Tubulin-GAL4 und UASp stehen, wird empfohlen, den Becher vor der Embryonenentnahme mindestens 3 Tage lang bei 18 °C zu halten. Diese Inkubationszeit ermöglicht es den Fliegen auch, sich an den Becher anzupassen und sich gut mit der Hefepaste zu ernähren, um eine optimale Eiproduktion zu erreichen.

2. Entnahme der Embryonen im gewünschten Stadium und Vorbereitung auf die optogenetische Stimulation

HINWEIS: Alle Schritte der Probenentnahme und -vorbereitung müssen in einem dunklen Raum durchgeführt werden, wobei ein "sicheres Licht" (z. B. rotes Licht) für die Beleuchtung verwendet werden muss. Die optogenetischen Komponenten reagieren sehr empfindlich auf Umgebungslicht. Schon die geringste Einwirkung von Umgebungslicht führt zu einer vorzeitigen Stimulation der Probe. Typischerweise verursachen Lichter im grün-roten Bereich (>532 nm) keine unerwünschte Stimulation.

  1. Für die Entnahme von Embryonen in der frühen Embryogenese wird 8 bis 16 Stunden vor der Embryonenentnahme (bei 18 °C) ein neuer Apfelsaftteller auf den Becher gelegt.
  2. Wechseln Sie zum Zeitpunkt der Embryonenentnahme die Apfelsaftplatte. Beschriften Sie die vom Becher abgenommene Platte und bedecken Sie die Oberfläche der Platte mit einer dünnen Schicht Halogenkohlenstofföl 27 (siehe Materialtabelle). Warten Sie 30-60 s, bis die Eierschale durchsichtig wird.
  3. Platzieren Sie eine orange-rote Kunststoffabschirmung (siehe Materialtabelle) auf dem Tisch eines aufrechten Stereoskops. Die Platzierung der orange-roten Abschirmung verhindert eine unerwünschte Stimulation während der Probenbeleuchtung, indem die blau-grünen Wellenlängen des transmittierten Lichts blockiert werden.
    HINWEIS: In diesem Protokoll wird ein aufrechtes Stereoskop für die Embryonenentnahme verwendet (siehe Materialtabelle).
  4. Den Apfelsaftteller auf das orangerote Schild stellen. Schalten Sie das Durchlicht des Stereomikroskops ein, um die Probe zu beleuchten. Entnehmen Sie 5-15 Embryonen im entsprechenden Stadium mit einer Pinzette von der Apfelsaftplatte. Drücken Sie die Embryonen nicht mit der Pinzette zusammen.
    HINWEIS: In diesem Protokoll sollte sich der entsprechende Embryo im frühen bis mittleren Zellularisierungsstadium befinden. Der Embryo sollte in diesem Stadium ein dunkles, undurchsichtiges Eigelb haben, das von einer klaren, gleichmäßigen Periplasmaschicht umgeben ist, die die sich bildenden Blastodermzellen enthält. Die Vorderkante der Spaltfurchen ("Zellularisierungsfront"), die als durchgehende Linie parallel zur Oberfläche des Embryos erscheint, sollte nicht über die Hälfte der Tiefe des Periplasmas hinausgehen.
  5. Tupfen Sie die Embryonen vorsichtig auf ein Stück Papiertuch (~1,5 cm × 1,5 cm), um überschüssiges Öl mit der Pinzette von den Embryonen zu entfernen.
  6. Geben Sie einige Tropfen frisch zubereitetes 40%iges Bleichmittel (~3% Natriumhypochlorit; siehe Materialtabelle) mit einer Plastiktransferpipette in ein neues kleines quadratisches Stück Papiertuch (~1,5 cm × 1,5 cm), so dass das Papiertuch mit einer dünnen Schicht Bleichmittel bedeckt ist. Übertragen Sie den Embryo mit der Pinzette vom trockenen Papiertuch auf das mit Bleichmittel getränkte Papiertuch und stellen Sie sicher, dass die Embryonen in Bleichmittel getränkt sind. Warten Sie 2-4 Minuten, bis der Embryo dechorioniert ist.
  7. Tupfen Sie nach der Dechorionation mit der Pinzette das quadratische Papiertuch auf ein großes Stück Seidenpapier, um überschüssiges Bleichmittel zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Seite mit den Embryonen nach oben zeigt.
  8. Um die Embryonen abzuspülen, weichen Sie das quadratische Papiertuch mit der Pinzette vorsichtig in einem Tropfen deionisiertem Wasser ein und tupfen Sie es schnell auf ein großes Stück Seidenpapier. Wiederholen Sie diesen Vorgang achtmal, um sicherzustellen, dass alle Bleichmittelrückstände entfernt werden.
  9. Verwenden Sie ein Wimpernwerkzeug, um den Embryo vom Papiertuch in eine 35 mm Glasbodenschale zu übertragen (siehe Materialtabelle). Geben Sie deionisiertes Wasser in die Schale, um die Embryonen vollständig zu bedecken. Feinabstimmung der Position und Ausrichtung der Embryonen mit dem Wimpernwerkzeug.
    HINWEIS: Nach der Dechorionation neigt der Embryo dazu, an der Oberfläche des Glases zu kleben und ist unbeweglich, ohne gestört zu werden, so dass es nicht notwendig ist, eine zusätzliche Behandlung (wie z.B. Klebstoff) anzuwenden, um den Embryo auf der Glasbodenschale zu immobilisieren.
  10. Legen Sie die 35-mm-Glasbodenschale mit den Embryonen in eine lichtdichte schwarze Box (siehe Materialtabelle), um die Probe während des Transfervorgangs vor Lichteinwirkung zu schützen. Bringen Sie die Box mit dem Multiphotonenmikroskop in den Raum.

3. Optogenetische Stimulation, Laserablation und Bildgebung des Embryos

ANMERKUNG: Das in diesem Experiment verwendete Multiphotonensystem (siehe Materialtabelle) ist in der Lage, gleichzeitig zwei Wellenlängen abzubilden. Es enthält auch eine Photostimulationseinheit mit einem 458-nm-Laser und einen separaten Galvanometer-Scanner, der eine Photoaktivierung/Stimulation innerhalb einer definierten Region of Interest (ROI) ermöglicht. Bemerkenswert ist, dass der 920-nm-Laser, der zur Anregung von grün-gelb fluoreszierenden Proteinen verwendet wird, Opto-Rho1DN stimuliert, wenn auch langsamer als die durch blaue Laser vermittelte Stimulation.

  1. Decken Sie das Multiphotonenmikroskop mit einem lichtdichten schwarzen Tuch ab (siehe Materialtabelle), um eine unerwünschte Stimulation der Embryonen während des Probenaufbaus und der Bildgebung zu vermeiden.
    HINWEIS: Der gleiche Ansatz wird bei der regulären Multiphotonen-Bildgebung verwendet, um die lichtempfindlichen Detektoren des Mikroskops zu schützen.
  2. Schalten Sie das Raumlicht und die Computerbildschirme aus. Schalten Sie den Touchpanel-Controller aus, indem Sie in der Software unter "Hintergrundbeleuchtung des Touchpanel-Controllers" auf OFF klicken. Stellen Sie sicher, dass sich kein anderes Umgebungslicht im Raum befindet.
    1. Öffnen Sie die Vorderseite der schwarzen Stoffabdeckung des Mikroskops. Nehmen Sie die 35-mm-Glasbodenschale aus der Blackbox und stellen Sie sie auf den Mikroskoptisch.
  3. Beleuchten Sie Embryonen mit einem grünen Licht, das normalerweise als Anregungslicht für die Epifluoreszenz verwendet wird. Schalten Sie dazu die Fluoreszenzbeleuchtung ein, wählen Sie in der Software unter dem Bedienfeld "Okular" die Option "Okular" und ändern Sie den "Würfelrevolver" auf 4:TRITC. Verwenden Sie das Okular, um den interessierenden Embryo zu identifizieren und in den Fokus zu rücken.
    HINWEIS: Die Grünlichtvisualisierung wird erreicht, indem ein von der Fluoreszenzbeleuchtungseinheit erzeugtes weißes Licht durch einen eingebauten Standard-TRITC-Filterwürfel geleitet wird, der einen 528-553-nm-Anregungsfilter, einen 565-nm-Strahlteiler und einen 590-650-nm-Emissionsfilter enthält. Andere nicht-blaue Lichter sollten ebenfalls gut für die Probenbeleuchtung geeignet sein. Das Tragen eines Augenschutzes ist in diesem Schritt nicht notwendig, da das Anregungslicht eine geringe Intensität hat und nicht auf das Okular gerichtet wird. Der Embryo erscheint aufgrund der Autofluoreszenz gleichmäßig rot.
  4. Schließen Sie die schwarze Stoffabdeckung, so dass die Probe vollständig vor Licht geschützt ist. Schalten Sie den Computerbildschirm ein, um auf die Software zuzugreifen, mit der das Mikroskop gesteuert wird. Ändern Sie das "Okular" in der Software für die Bildaufnahme auf LSM .
  5. Führen Sie eine Laserablation an kontrollierten, nicht stimulierten Embryonen mit einem 25-fachen Wasserimmersionsobjektiv durch.
    1. Klicken Sie im "Tool-Fenster" der Software auf Bright Z, Sequence Manager und LSM Stimulation. Stellen Sie den Scannertyp auf Galvano und die Scangröße auf 512 × 512 ein. Schalten Sie CH1 und CH3 unter dem Feld "PMT-Einstellung" ein, um die Verwendung des 1.040-nm-Lasers zu ermöglichen, und klicken Sie auf Live × 4, um den Embryo zu visualisieren.
    2. Drehen Sie den Embryo mit der Rotationsfunktion in der Software so, dass die vordere und hintere Achse des Embryos vertikal ausgerichtet ist. Stellen Sie den Zoom auf 3 ein. Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) mit dem Formwerkzeug unter "Scaneinstellungen" und legen Sie die Größe der ROI im Bedienfeld "Referenz" fest. Legen Sie die ROI auf 512 Pixel in der Breite und 100 Pixel in der Höhe (171 × 33 μm2) fest.
    3. Legen Sie die Erfassungsparameter für den Z-Stapel vor der Ablation fest.
      1. Registrieren Sie die Oberfläche des Embryos als 0 unter dem "Z-Abschnitt". Stellen Sie den Anfang auf 0 und das Ende auf 100 μm ein. Stellen Sie die Schrittweite auf 2 μm ein. Aktivieren Sie den Z-Erfassungsmodus, indem Sie Z auf der Registerkarte "Serie" aktivieren.
      2. Stellen Sie die Laserintensität von 1.040 nm ein, um sie mit der Funktion "Bright Z " linear von 3 % auf 7 % zu erhöhen.
      3. Speichern Sie die aktuelle Imaging-Einstellung als erste Aufgabe der Pipeline, indem Sie in "Sequence Manager" auf LSM klicken.
        HINWEIS: Der Z-Stapel vor der Ablation wird entnommen, um das Stadium des Embryos zu bestätigen. In diesem Experiment werden CRY2-Rho1DN-mCherry und Sqh-mCherry durch den 1.040-nm-Laser angeregt. Während der apikalen Konstriktion ist das Sqh-mCherry-Signal in der medioapikalen Region der ventralen mesodermalen Zellen verstärkt, während CRY2-Rho1DN-mCherry vor der Stimulation zytosolisch ist. Die Laserintensität, die für die Bildgebung vor und nach der Stimulation verwendet wird, wird empirisch anhand des Gleichgewichts zwischen dem optimalen Signal-Rausch-Verhältnis und der Vermeidung von Photobleaching bestimmt.
    4. Legen Sie die Aufnahmeparameter für den Film vor der Ablation fest.
      1. Löschen Sie alle vorhandenen ROI, um die Abbildung des gesamten 512 × 512 Pixelbereichs (171 × 171 μm 2, 3-facher Zoom) in der Nähe der ventralen Oberfläche des Embryos zu ermöglichen, wie in Schritt 3.5.2 beschrieben. Stellen Sie die Laserintensität von 1.040 nm auf 3 % ein.
      2. Aktivieren Sie die Zeit, und deaktivieren Sie Z unter dem Bedienfeld "Reihe". Behalten Sie das "Intervall" als FreeRun unter dem Bereich "Zeitraffer" bei. Stellen Sie den Zyklus auf 10 ein.
      3. Speichern Sie die aktuellen Einstellungen als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie in "Sequence Manager" auf LSM klicken.
        HINWEIS: Der Zweck dieser Aufgabe besteht darin, einen 10-Frame-Einzel-Z-Ebenen-Vorablationsfilm mit einem 1.040-nm-Laser für die Bildaufnahme zu erhalten. Die Bildaufnahmegeschwindigkeit beträgt ca. 1 s pro Bild.
    5. Stellen Sie die Parameter für die Laserablation ein.
      1. Definieren Sie einen 3D-Bereich von unmittelbar unterhalb der Vitellinmembran bis zu ~20 μm Tiefe für die Laserablation (Abbildung 1A). Legen Sie den Anfang des Z-Stapels als die Ebene fest, die sich unmittelbar unter der Vitellinmembran befindet, und das Ende als 20 μm tiefer als die Startebene. Stellen Sie die Schrittweite auf 1,5 μm ein.
        HINWEIS: Der ROI des abgetragenen Bereichs beträgt ~30 Pixel in der Breite und ~10 Pixel in der Höhe (~10 μm entlang der medial-lateralen Achse und ~3,3 μm entlang der A-P-Achse). Der Zweck der Ablation der Probe in mehreren Z-Ebenen besteht darin, sicherzustellen, dass die apikale Oberfläche der ventralen Zellen abgetragen wird. Dies ist besonders wichtig für die stimulierten Embryonen, da die ventralen Zellen nach der Rho1-Hemmung eine schnelle apikale Entspannung erfahren.
      2. Schalten Sie CH2 und CH4 unter dem Bedienfeld "PMT-Einstellung" ein, um die Verwendung des 920-nm-Lasers zu ermöglichen. Stellen Sie die Intensität des 920-nm-Lasers auf 30 % ein. Stellen Sie die Bildaufnahme mit dem 920-nm-Laser für einen einzelnen Z-Stapel innerhalb des in Schritt 3.5.5.1 definierten 3D-Bereichs für die Laserablation ein.
        HINWEIS: Die in diesem Schritt gewählte Laserintensität reicht aus, um das Gewebe abzutragen (wie durch den Geweberückstoß unmittelbar nach der Laserbehandlung angezeigt), schädigt aber die Plasmamembran nicht offensichtlich (wie durch das Fehlen von Brandflecken auf der Zellmembran angezeigt) (Abbildung 1B,C).
      3. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im "Sequenz-Manager" auf LSM klicken.
    6. Legen Sie die Aufnahmeparameter für den Film nach der Ablation fest.
      1. Stellen Sie die Bildaufnahme für einen 100-Frame-Film mit einer einzelnen Z-Ebene nach der Ablation sowohl mit dem 1.040-nm- als auch mit dem 920-nm-Laser ein. Stellen Sie die Intensität des 1.040-nm-Lasers und des 920-nm-Lasers auf 3 % bzw. 0,3 % ein. Der in Schritt 3.5.4 angegebene Bereich wird mit identischer Bildaufnahmegeschwindigkeit abgebildet.
      2. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im "Sequenz-Manager" auf LSM klicken.
        ANMERKUNG: Der Zweck der Speicherung der in den Schritten 3.5.3-3.5.6 beschriebenen Parameter als sequentielle Aufgaben im "Sequenz-Manager" vor jeder tatsächlichen Erfassung besteht darin, die Erfassung der unmittelbaren Gewebereaktion nach der Laserablation sicherzustellen.
    7. Wählen Sie unter "Erfassen" die Option "Sequenz" aus. Ändern Sie den Datenspeicherpfad und den Dateinamen nach Bedarf. Klicken Sie auf Bereit, und warten Sie, bis die Software die Pipeline initialisiert hat. Klicken Sie dann auf Starten , um die Pipeline auszuführen.
  6. Führen Sie eine Laserablation bei stimulierten Embryonen durch.
    1. Legen Sie die Erfassungsparameter für den Z-Stapel vor der Ablation fest, wie in den Schritten 3.5.1-3.5.3 beschrieben. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als erste Aufgabe der Pipeline, indem Sie in "Sequence Manager" auf LSM klicken.
    2. Stellen Sie Parameter für die optogenetische Stimulation innerhalb eines definierten ROI ein.
      1. Ändern Sie den Zoom auf 1 und wählen Sie eine ROI, die die ventrale Oberfläche des Embryos abdeckt (~512 × 300 μm2). Schalten Sie die CH1-CH4-Melder aus.
      2. Klicken Sie auf LSM-Stimulation. Deaktivieren Sie Kontinuierlich innerhalb der Dauer und geben Sie 12 s ein. Prüfen Sie die 458 nm mit 0,3 % Laserintensität.
      3. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im 'Sequence Manager' auf Stimulation klicken.
        HINWEIS: Eine schnellere Stimulation kann durch eine Erhöhung der Laserintensität von 458 nm erreicht werden. Bei Verwendung höherer Laserintensitäten kann das gestreute Laserlicht jedoch den an den ROI angrenzenden Bereich stimulieren, was nicht ideal ist, wenn eine räumlich begrenzte Stimulation erforderlich ist.
    3. Stellen Sie eine Wartezeit von 3 Minuten nach der Stimulation ein, um eine vollständige Inaktivierung von Myosin und den Abbau von apikalem F-Aktin zu gewährleisten und eine statische Gewebemorphologie vor der Laserablation zu erreichen. Dies erreichen Sie, indem Sie unter "Sequenzmanager" auf Warten /Pause klicken und die gewünschte Zeit für "Warten" einstellen.
      HINWEIS: Die Rekrutierung von CRY2-Rho1DN-mCherry an die Membran, die durch eine einzige Stimulationsrunde (0,3% 458 nm Laser für 12 s) verursacht wird, ist 10-15 Minuten nach der Stimulation deutlich nachweisbar. Dies stimmt mit der veröffentlichten Dissoziationshalbzeit von ~9 min47 überein.
    4. Legen Sie die Aufnahmeparameter für den einzelnen Z-Ebenen-Vorablationsfilm fest, wie in Schritt 3.5.4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass sowohl der 1.040-nm- als auch der 920-nm-Laser für die Bildaufnahme verwendet werden. Schalten Sie die CH1-CH4-Melder ein. Stellen Sie die Intensität des 1.040-nm-Lasers und des 920-nm-Lasers auf 3 % bzw. 0,3 % ein. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im "Sequenz-Manager" auf LSM klicken.
    5. Stellen Sie die Parameter für die Laserablation ein, wie in Schritt 3.5.5 beschrieben. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im "Sequenz-Manager" auf LSM klicken.
    6. Legen Sie die Aufnahmeparameter für den einzelnen Film nach der Ablation auf der Z-Ebene fest, wie in Schritt 3.5.6 beschrieben. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im "Sequenz-Manager" auf LSM klicken.
    7. Wählen Sie unter "Erfassen" die Option "Sequenz" aus. Ändern Sie den Datenspeicherpfad und den Dateinamen nach Bedarf. Klicken Sie auf Bereit, und warten Sie, bis die Software die Pipeline initialisiert hat. Klicken Sie dann auf Starten, um die Pipeline auszuführen.

4. Quantifizierung der Rückstoßrate des Gewebes nach Laserablation

  1. Öffnen Sie den Film nach der Ablation in ImageJ.
  2. Zeichnen Sie eine kleine ROI entlang der ventralen Mittellinie, die den abgetragenen Bereich abdeckt, mit dem Rechteckauswahl-Werkzeug . Die Breite des ROI beträgt neun Pixel. Die Höhe des ROI ist so eingestellt, dass der ROI groß genug ist, um den gesamten Bereich des Geweberückstoßes nach der Laserablation abzudecken.
    1. Klicken Sie auf der Registerkarte "Bild" auf Duplizieren. Aktivieren Sie im Pop-up-Fenster die Option Stapel duplizieren und klicken Sie dann auf OK, um den Stapel innerhalb der ausgewählten ROI zu duplizieren.
  3. Generieren Sie eine Montage aus dem duplizierten Stapel über Bild- > Stapel > Montage erstellen. Legen Sie im Pop-up-Fenster die Zeilennummer auf 1 und die Spaltennummer auf die Gesamtzahl der Frames im Stapel (in diesem Fall 100 ) fest.
  4. Messen Sie die A-P-Breite des abgetragenen Bereichs über die Zeit aus der generierten Montage.
    1. Verwenden Sie das Multi-Point-Werkzeug in ImageJ, um die A-P-Grenzen des abgetragenen Bereichs für jeden Zeitpunkt in der Montage zu markieren.
    2. Speichern Sie die Koordinaten der markierten Punkte mit Datei > Speichern als > XY-Koordinaten.
    3. Importieren Sie die gemessenen XY-Koordinaten in MATLAB. Berechnen Sie die A-P-Breite des abgetragenen Bereichs für jeden Zeitpunkt, indem Sie die Y-Koordinate der oberen Begrenzung von der Y-Koordinate der unteren Begrenzung subtrahieren.
  5. Bestimmen Sie die Rückstoßrate des Gewebes, indem Sie die ersten 20 s der "Breite über die Zeit"-Kurve mit der "polyfit"-Funktion in MATLAB in eine Linie einpassen. Geben Sie die Steigung der angepassten Linie als Rückstoßrate des Gewebes an.
  6. Führen Sie statistische Tests durch, um die Rückstoßrate des Gewebes zwischen den stimulierten und nicht stimulierten Proben zu vergleichen.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, Daten von mindestens fünf Embryonen pro Erkrankung zu erhalten. Sowohl der zweiseitige Wilcoxon-Rangsummentest als auch der zweiseitige Schüler-t-Test können für statistische Vergleiche verwendet werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In den nicht stimulierten Embryonen, die einer apikalen Konstriktion unterzogen wurden, wurde Sqh-mCherry in der medioapikalen Region der ventralen mesodermalen Zellen angereichert, während CRY2-Rho1DN-mCherry zytosolisch war (Abbildung 1A). Die Laserablation innerhalb der Verengungsdomäne führte zu einem raschen Geweberückstoß entlang der A-P-Achse (Abbildung 1B,C). In den stimulierten Embryonen wurde das CRY2-Rho1DN-mCherry-Signal in der Plasmamembran lokalisiert, während das medioapikale Signal von Sqh-mCherry vollständig verschwand (Abbildung 1A). Die Laserablation bei den stimulierten Embryonen führte nicht zu einem offensichtlichen Geweberückstoß, wie in Abbildung 1B,C beispielhaft dargestellt und in Abbildung 1D quantifiziert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Erzeugung von Gewebespannung eine aktive apikale Actomyosin-Kontraktilität erfordert; Wenn Actomyosin bei der Hemmung von Rho1 inaktiv wird, nimmt auch die apikale Gewebespannung ab41. Diese Beobachtungen stimmen mit den früheren Befunden überein, dass die Aktivierung der apikalen Myosinkontraktilität in ventralen mesodermalen Zellen zu einer Erhöhung der Gewebespannung an der ventralen Oberfläche des Embryos führt40.

Figure 1
Abbildung 1: Die Opto-Rho1DN-Stimulation während der apikalen Konstriktion führt zu einem sofortigen Verlust der kortikalen Spannung an der ventralen Oberfläche des Embryos . (A) Karikatur mit dem Versuchsaufbau für die Laserablation zum Nachweis kortikaler Spannungen. Gelb schattierte Bereiche kennzeichnen die abgetragenen Regionen. Bei stimulierten Embryonen wurde die Lichtaktivierung von Opto-Rho1DN 3 Minuten vor der Laserablation durchgeführt. Aufgrund der apikalen Relaxation nach der Stimulation wurden mehrere z-Ebenen abgetragen (gelb schattierter Bereich), um die Ablation der apikalen Oberfläche der ventralen Zellen zu gewährleisten. (B,C) Vergleich zwischen nicht stimulierten und stimulierten Embryonen. Bei den stimulierten Embryonen wurde kein offensichtlicher Geweberückstoß beobachtet (N = 6 für nicht stimulierte Embryonen und N = 5 für stimulierte Embryonen). (B) Gesichtsansicht der laserabgetragenen Embryonen. Gelb schattierte Kästchen markieren den abgetragenen Bereich. (C) Kymographen, die die Breitenänderung des abgetragenen Bereichs darstellen. Gelb gestrichelte Linien zeigen die Ablationsstelle an. (D) Breitenänderungen des abgetragenen Bereichs entlang der A-P-Achse während der ersten 20 s nach der Laserablation. Ein deutlicher Geweberückstoß wurde nach dem Laserschneiden bei den nicht stimulierten Kontrollembryonen beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde bei den stimulierten Embryonen wenig bis gar kein Geweberückstoß beobachtet, was auf einen Mangel an apikaler Spannung nach Rho1-Hemmung hindeutet. Der Fehlerbalken ist die Standardabweichung. Der p-Wert wurde mit einem zweiseitigen Wilcoxon-Rangsummentest berechnet. Diese Abbildung wird von Guo et al.41 wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dieses Protokoll beschrieb den kombinierten Einsatz von Optogenetik und Laserablation, um Veränderungen der Gewebespannung unmittelbar nach der Inaktivierung der Aktomyosin-Kontraktilität zu untersuchen. Das hier beschriebene optogenetische Werkzeug nutzt die dominante negative Form von Rho1 (Rho1DN), um die endogene Rho1- und Rho1-abhängige Actomyosin-Kontraktilität akut zu hemmen. Die vorherige Charakterisierung von Opto-Rho1DN im Zusammenhang mit der ventralen Furchenbildung von Drosophila zeigte, dass das Werkzeug hochwirksam bei der Vermittlung der schnellen Inaktivierung der apikalen Aktomyosin-Kontraktilität durch gleichzeitige Myosin-Inaktivierung und Aktin-Demontage ist41. Insbesondere führte die Stimulation von Embryonen zum Zeitpunkt der apikalen Konstriktion zu einer Reduktion des apikalen Myosinsignals innerhalb von 60 s in Zellen, die eine apikale Konstriktion erfuhren41. Diese schnelle Entfernung von kortikalem Myosin bei Rho1-Hemmung ist wahrscheinlich auf den schnellen Zyklus von Rho1 und Myosin durch aktive und inaktive Zustände zurückzuführen, der durch die Aktivitäten von GTPase-aktivierenden Proteinen (GAPs) für Rho1- bzw. Myosin-Leichtkettenphosphatasen verursacht wird19,54. In Übereinstimmung mit dem Einfluss auf Actomyosin zeigte die Kopplung der Optogenetik mit der Laserablation, dass die Opto-Rho1DN-Stimulation während der apikalen Konstriktion zu einem sofortigen Verlust der Epithelspannung in der ventralen Region des Embryos führte41 (Abbildung 1). Dieser kombinierte Ansatz ermöglichte es uns, die Funktion der Rho1-vermittelten zellulären Kontraktilität bei der Regulation der Gewebemechanik mit bisher unerreichter räumlicher und zeitlicher Präzision zu untersuchen, was es ermöglichte, unmittelbare Auswirkungen von Langzeiteffekten zu analysieren, die mit herkömmlichen genetischen Ansätzen nur schwer zu erreichen sind.

Ein wichtiger technischer Aspekt bei der Verwendung von Opto-Rho1DN ist, dass das Gerät sehr empfindlich auf Umgebungslicht reagiert. Ein häufig auftretendes Problem im Experiment ist die Rekrutierung von CRY2-mCherry-Rho1DN an die Plasmamembran vor dem Stimulationsschritt, die typischerweise durch eine vorzeitige Stimulation der Probe während eines der folgenden Schritte verursacht wird: Probenvorbereitung, Probentransfer in den Mikroskopraum, Probenpositionierung auf dem Mikroskoptisch und Bildaufnahme vor der Stimulation. In unserem Protokoll werden mehrere Verfahren angewendet, um eine unerwünschte Stimulation zu verhindern, einschließlich der Handhabung der Fliegenbecher und Embryonen in einem dunklen Raum unter rotem Licht, des Herausfilterns blauer Wellenlängen aus dem Beleuchtungslicht bei der Auswahl und Montage von Embryonen unter dem Stereomikroskop und der Vermeidung der Exposition von Embryonen gegenüber einem 400-500 nm Laser (Einzelphotonenanregung) oder einem 830-980 nm gepulsten Laser (Multiphotonenanregung) vor der Stimulation. Es ist wichtig, in mehreren Schritten des Experiments besondere Aufmerksamkeit walten zu lassen, um eine unerwünschte Stimulation der Probe zu vermeiden. Darüber hinaus wird bei der Verwendung von Opto-Rho1DN zur Hemmung von Rho1 innerhalb einer spezifischen Region of Interest (ROI) im Embryo41 empfohlen, die niedrigste Laserintensität zu verwenden, die eine robuste Translokation von CRY2-Rho1DN zur Plasmamembran erreichen kann. Da Opto-Rho1DN extrem empfindlich auf blaue Wellenlängen reagiert, kann ein hochintensiver blauer Laser aufgrund von Streulicht zu unerwünschten Stimulationen in Zellen außerhalb des ROI oder sogar in benachbarten Embryonen führen.

In seiner aktuellen Version weist das Opto-Rho1DN-Tool einige Einschränkungen auf. Zunächst wurde für die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente ein in der Plasmamembran lokalisierter CIBN-Anker verwendet, um aktiviertes CRY2-Rho1DN aus dem Zytosol in die Plasmamembran zu rekrutieren41,47. Durch dieses Design ist es aufgrund der Diffusion von aktivierten CRY2-Rho1DN-Proteinen im Zytosol schwierig, eine begrenzte Rho1-Hemmung innerhalb einer spezifischen Plasmamembrandomäne durchzuführen. Eine weitere Verbesserung der räumlichen Präzision auf subzellulärer Ebene wartet auf die Entwicklung neuer CIBN-Anker, die spezifischere subzelluläre Lokalisierungsmuster aufweisen. Zweitens wurde Opto-Rho1DN entwickelt, um Rho1 während der frühen Embryogenese zu hemmen. Die Expression von CIBNpm und CRY2-Rho1DN-mCherry wird durch UASp kontrolliert, das für die Expression in weiblichen Keimbahnen standardisiert ist 55. Die Expression dieser Module in somatischen Geweben über die frühe Embryogenese hinaus kann den Ersatz von UASp durch einen Promotor erfordern, der für die Steuerung der somatischen Expression wirksamer ist (z. B. UASt56). Schließlich hängt die Wirksamkeit von Opto-Rho1DN von der Häufigkeit der CIBN-Anker- und CRY2-Rho1DN-Proteine ab. In der aktuellen Version des Tools wird sie durch die GAL4-Treiberzeile bestimmt, die zur Steuerung der Expression der optogenetischen Module verwendet wird. Bei der Verwendung des in diesem Protokoll beschriebenen mütterlichen GAL4-Treibers ist es wichtig, die Linie zu verwenden, die zwei Kopien des GAL4-Gens (z. B. sowohl 67 als auch 15) bereitstellt, um die schnelle und starke Hemmung der Actomyosin-Kontraktilität zu erreichen. Die Reduzierung der Kopienzahl von mütterlichem GAL4 bei den F1-Weibchen von zwei auf eins reduzierte die hemmende Wirkung signifikant.

Im Vergleich zu konventionellen genetischen Ansätzen ist der in diesem Protokoll beschriebene optogenetische Ansatz vorteilhaft, um das Stadium und die gewebespezifische Funktion von Rho1 in frühen Drosophila-Embryonen zu untersuchen. Die Funktion von Rho1 in der frühen Embryogenese von Drosophila wird weitgehend durch das maternal beladene Genprodukt11 erfüllt. Der Abbau von Rho1 blockiert mütterlich die Oogenese57 und verhindert die Untersuchung seiner Funktion während der frühen Embryogenese. In den letzten Jahren wurden mehrere optogenetische Werkzeuge entwickelt, um die endogene Rho1-Aktivität in Drosophila-Embryonen zu regulieren. Sowohl Izquierdo et al. als auch Rich et al. entwickelten optogenetische Werkzeuge, um die Rho1-Aktivität zu aktivieren, indem sie die Lokalisierung der katalytischen Domäne von Rho-GEFs in Drosophila-Embryonen regulieren48,58. Darüber hinaus entwickelten Herrera-Perez et al. zwei optogenetische Werkzeuge, die entweder RhoGEF2 in voller Länge (optoGEF) oder C-GAP in voller Länge (optoGAP) verwenden, um die endogene Rho1-Aktivität zu aktivieren bzw. zu hemmen59. Da optoGAP funktioniert, indem es eine Rho1-GAP an die Plasmamembran rekrutiert, kann seine Anwendung empfindlich auf das Vorhandensein von endogenen Rho1-GEFs reagieren, die den Effekt der ektopischen Rekrutierung der GAP ausgleichen oder sogar außer Kraft setzen können. Im Gegensatz dazu könnte Opto-Rho1DN durch die direkte Sequestrierung von Rho1-GEFs eine robustere Möglichkeit bieten, die endogene Rho1- und Rho1-abhängige Actomyosin-Kontraktilität zu hemmen.

Angesichts des breiten Funktionsspektrums von Rho1 in der Embryogenese und postembryonalen Entwicklung kann das vorgestellte Protokoll leicht angepasst werden, um die Funktion von Rho1- und Rho1-abhängigen zellulären Reorganisationen in einem breiten Spektrum morphogenetischer Prozesse zu untersuchen. Darüber hinaus kann eine ähnliche Strategie prinzipiell verwendet werden, um andere kleine GTPasen, wie z. B. die GTPasen der Rho-Familie Cdc42 und Rac, stark einzuschränken, da ihre dominanten negativen Formen häufig verwendet wurden, um die endogene Funktion dieser Proteine zu hemmen11. Wie in diesem Protokoll veranschaulicht, kann die Kombination von Optogenetik und Laserablation eine effektive Möglichkeit bieten, die unmittelbaren Auswirkungen der Inaktivierung eines bestimmten Proteins auf die Gewebedynamik und Gewebemechanik zu untersuchen, was uns neue Einblicke in die Gewebemorphogenese bringen wird, die mit herkömmlichen genetischen Ansätzen nur schwer aufzudecken sind.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Acknowledgments

Die Autoren danken Ann Lavanway für die Unterstützung bei der Bildgebung. Die Autoren danken dem Wieschaus-Labor und dem De Renzis-Labor für die gemeinsame Nutzung der Reagenzien und dem Bloomington Drosophila Stock Center für die Fliegenbestände. Diese Studie wird durch den NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 und den American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 an BH unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  2. Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
  3. Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. Developmental Biology. 341 (1), 5-19 (2010).
  4. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  5. Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
  6. Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
  7. Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
  8. Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
  9. Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
  10. Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
  11. Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
  12. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  13. Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
  14. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  15. Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
  16. Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
  17. Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
  18. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  19. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  20. Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
  21. Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
  22. Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
  23. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  24. Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
  25. Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. Genetics. 214 (3), 543-560 (2020).
  26. Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
  27. Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629 (2020).
  28. Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
  29. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  30. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  31. Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
  32. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
  33. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  34. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  35. Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  36. Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
  37. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
  38. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  39. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  40. Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
  41. Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082 (2022).
  42. Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
  43. Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
  44. Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
  45. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  46. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  47. Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
  48. Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366 (2018).
  49. Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  50. Rauzi, M., Lenne, P. -F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
  51. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  52. Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
  53. Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
  54. Munjal, A., Philippe, J. -M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
  55. Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
  56. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  57. Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
  58. Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893 (2020).
  59. Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).

Tags

Entwicklungsbiologie Ausgabe 194 Optogenetik Gewebemechanik Rho1 Actomyosin Laserablation apikale Verengung Gastrulation
Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in <em>Drosophila-Embryonen</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, H., Swan, M., He, B.… More

Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter