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Developmental Biology

Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di Drosophila

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65314
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

Summary

La contrattilità dell'actomiosina svolge un ruolo importante nella morfogenesi cellulare e tissutale. Tuttavia, è difficile manipolare la contrattilità dell'actomiosina in vivo in modo acuto. Questo protocollo descrive un sistema optogenetico che inibisce rapidamente la contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 negli embrioni di Drosophila , rivelando l'immediata perdita di tensione epiteliale dopo l'inattivazione dell'actomiosina in vivo.

Abstract

Le forze contrattili generate dall'actina e dalla miosina II non muscolare ("contrattilità dell'actomiosina") sono fondamentali per i cambiamenti morfologici di cellule e tessuti su più scale di lunghezza, come la divisione cellulare, la migrazione cellulare, il ripiegamento epiteliale e la morfogenesi ramificata. Una comprensione approfondita del ruolo della contrattilità dell'actomiosina nella morfogenesi richiede approcci che consentano la rapida inattivazione dell'actomiosina, che è difficile da ottenere utilizzando approcci genetici o farmacologici convenzionali. Il protocollo presentato dimostra l'uso di un sistema di dimerizzazione optogenetica basato su CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, per inibire la contrattilità dell'actomiosina negli embrioni di Drosophila con precisi controlli temporali e spaziali. In questo sistema, CRY2 è fuso con la forma negativa dominante di Rho1 (Rho1DN), mentre CIBN è ancorato alla membrana plasmatica. La dimerizzazione mediata dalla luce blu di CRY2 e CIBN provoca una rapida traslocazione di Rho1DN dal citoplasma alla membrana plasmatica, dove inattiva l'actomiosina inibendo Rho1 endogeno. Inoltre, questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'accoppiamento dell'inattivazione dell'actomiosina mediata da Opto-Rho1DN con l'ablazione laser per studiare il ruolo dell'actomiosina nella generazione di tensione epiteliale durante la formazione del solco ventrale di Drosophila . Questo protocollo può essere applicato a molti altri processi morfologici che coinvolgono la contrattilità dell'actomiosina negli embrioni di Drosophila con modifiche minime. Nel complesso, questo strumento optogenetico è un potente approccio per analizzare la funzione della contrattilità dell'actomiosina nel controllo della meccanica tissutale durante il rimodellamento dinamico dei tessuti.

Introduction

La contrattilità dell'actomiosina, la forza contrattile esercitata dalla miosina II non muscolare (di seguito «miosina») sulla rete di F-actina, è una delle forze più importanti nel modificare la forma delle cellule e nel guidare la morfogenesi a livello tissutale 1,2. Ad esempio, l'attivazione della contrattilità dell'actomiosina nel dominio apicale delle cellule epiteliali provoca una costrizione apicale, che facilita una varietà di processi morfogenetici, tra cui il ripiegamento epiteliale, l'estrusione cellulare, la delaminazione e la guarigione delle ferite 3,4,5,6,7 . L'attivazione della miosina richiede la fosforilazione della sua catena leggera regolatrice. Questa modifica allevia la conformazione inibitoria delle molecole di miosina, consentendo loro di formare fasci di filamenti di miosina bipolari con più domini di testa su entrambe le estremità. I filamenti bipolari di miosina guidano il movimento antiparallelo dei filamenti di actina e provocano la generazione della forza contrattile 1,8,9.

La piccola GTPasi RhoA della famiglia Rho, evolutivamente conservata, svolge un ruolo centrale nell'attivazione della contrattilità dell'actomiosina in vari contesti cellulari 10,11. Rho1 funziona come un interruttore bimolecolare legando GTP (forma attiva) o GDP (forma inattiva)12. Il ciclo tra Rho1 legato al GTP o al GDP è regolato dalle sue proteine attivanti la GTPasi (GAP) e dai fattori di scambio dei nucleotidi guanina (GEF)13. I GEF hanno la funzione di facilitare lo scambio di PIL con GTP e quindi di attivare l'attività di Rho1. I GAP, d'altra parte, potenziano l'attività GTPasica di Rho1 e quindi disattivano Rho1. Rho1 attivato promuove la contrattilità dell'actomiosina attraverso l'interazione e l'attivazione dei suoi effettori a valle, la chinasi associata a Rho (Rok) e la Diafana14. Rok induce l'attivazione della miosina e la contrattilità dell'actomiosina fosforilando la catena leggera regolatoria della miosina15. Inoltre, Rok inibisce anche la fosfatasi a catena leggera regolatrice della miosina e quindi promuove ulteriormente l'assemblaggio del filamento di miosina16. Rok può anche fosforilare le chinasi LIM che, una volta attivate, impediscono il disassemblaggio dell'actina fosforilando e inibendo il fattore di depolimerizzazione dell'actina cofilina17,18. Diaphanous è un nucleatore di actina della famiglia delle formine che promuove la polimerizzazione dell'actina, fornendo una base per l'interazione della miosina con 19,20,21.

Mentre i meccanismi cellulari che attivano la contrattilità dell'actomiosina sono stati ben chiariti, la nostra comprensione della sua funzione nella regolazione del rimodellamento dinamico dei tessuti rimane incompleta. Per colmare questa lacuna di conoscenze sono necessari approcci in grado di inattivare rapidamente l'actomiosina in specifiche regioni tissutali in vivo e di registrare l'impatto immediato sul comportamento e sulle proprietà dei tessuti. Questo protocollo descrive l'uso di un approccio optogenetico per inibire in modo acuto la contrattilità dell'actomiosina durante l'invaginazione del mesoderma di Drosophila, seguito dalla misurazione della tensione epiteliale mediante ablazione laser. Durante la gastrulazione di Drosophila, le cellule precursori del mesoderma localizzate ventralmente subiscono una costrizione apicale e si invaginano dalla superficie dell'embrione formando un solco orientato antero-posteriormente22,23. La formazione di solchi ventrali è stata a lungo utilizzata come modello per studiare il meccanismo del ripiegamento epiteliale. La formazione di solchi ventrali è amministrata dal sistema di pattern dorso-ventrale in Drosophila24,25,26,27. L'espressione di due fattori di trascrizione, Twist e Snail, situati sul lato ventrale dell'embrione, controlla la formazione del solco ventrale e specifica il destino delle cellule mesodermiche28. Twist e Snail attivano il reclutamento di Rho1 GEF RhoGEF2 all'apice delle cellule precursori del mesoderma attraverso una via recettoriale accoppiata a proteina G e una proteina adattatrice RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. Successivamente, RhoGEF2 attiva la miosina in tutta la superficie apicale del potenziale mesoderma attraverso la via chinasica Rho-Rho 34,35,36,37,38,39. La miosina attivata forma una rete di actomiosina supracellulare in tutta la superficie apicale del mesoderma primordiale, le cui contrazioni guidano la costrizione apicale e provocano un rapido aumento della tensione del tessuto apicale 14,37,40.

Lo strumento optogenetico descritto in questo protocollo, Opto-Rho1DN, inibisce la contrattilità dell'actomiosina attraverso il reclutamento sulla membrana plasmatica dipendente dalla luce blu di una forma dominante negativa di Rho1 (Rho1DN)41. Una mutazione T19N in Rho1DN elimina la capacità della proteina mutante di scambiare il GDP con il GTP e quindi rende la proteina perennemente inattiva34. Una successiva mutazione in Rho1DN, C189Y, elimina il suo naive segnale di targetingdi membrana 42,43. Quando Rho1DN viene infuso nella membrana plasmatica, si lega e trattiene i GEF di Rho1, bloccando così l'attivazione di Rho1 e l'attivazione mediata da Rho1 della miosina e dell'actina34,44. Il reclutamento di Rho1DN sulla membrana plasmatica è ottenuto attraverso un modulo di dimerizzazione dipendente dalla luce derivato dal Criptocromo 2 e dal suo partner di legame CIB1. Il criptocromo 2 è un fotorecettore del criptocromo attivato dalla luce blu in Arabidopsis thaliana45. Il criptocromo 2 si lega a CIB1, una proteina basica elica-loop-elica, solo nel suo stato fotoeccitato45. In seguito si è scoperto che la regione di omologia della fotoliasi N-terminale conservata (PHR), dal criptocromo 2 (CRY2PHR, di seguito denominato CRY2) e il dominio N-terminale (aa 1-170) di CIB1 (da qui in poi CIBN) sono importanti per la dimerizzazione indotta dalla luce46. Opto-Rho1DN contiene due componenti. Il primo componente è la proteina CIBN fusa con un'ancora CAAX, che localizza la proteina sulla membrana plasmatica47. Il secondo componente è CRY2 marcato con mCherry fuso con Rho1DN41. In assenza di luce blu, CRY2-Rho1DN rimane nel citoplasma. Dopo la stimolazione con luce blu, CRY2-Rho1DN viene indirizzato alla membrana plasmatica attraverso l'interazione tra CIBN ancorato alla membrana e CRY2 eccitato. Opto-Rho1DN può essere attivato dalla luce ultravioletta A (UVA) e dalla luce blu (400-500 nm, picco di attivazione a 450-488 nm), o da un laser pulsato da 830-980 nm durante l'esecuzione di stimolazione a due fotoni41,46,47,48. Pertanto, Opto-Rho1DN è stimolato dalle lunghezze d'onda normalmente utilizzate per eccitare la GFP (488 nm per l'imaging a singolo fotone e 920 nm per l'imaging a due fotoni). Al contrario, le lunghezze d'onda comunemente utilizzate per l'eccitazione di mCherry (561 nm per l'imaging a singolo fotone e 1.040 nm per l'imaging a due fotoni) non stimolano il modulo optogenetico e quindi possono essere utilizzate per l'imaging di pre-stimolazione. Il protocollo descrive gli approcci utilizzati per ridurre al minimo il rischio di stimolazione indesiderata durante la manipolazione del campione.

L'ablazione laser è stata ampiamente impiegata per rilevare e misurare la tensione nelle cellule e nei tessuti49. Studi precedenti hanno dimostrato che, quando l'intensità del laser è adeguatamente controllata, l'ablazione laser a due fotoni che impiega un laser a femtosecondi nel vicino infrarosso può compromettere fisicamente alcune strutture subcellulari (ad esempio, le reti corticali di actomiosina) senza causare il rapimento della membrana plasmatica50,51. Se il tessuto è sotto tensione, l'ablazione laser di una regione di interesse all'interno del tessuto provoca un immediato rinculo verso l'esterno delle cellule adiacenti alla regione ablata. La velocità di rinculo è funzione dell'entità della tensione e della viscosità del mezzo (citoplasma) che circonda le strutture sottoposte a rinculo49. A causa della profondità di penetrazione superiore dei laser nel vicino infrarosso e della capacità di ottenere un'ablazione focale ben confinata, l'ablazione laser a due fotoni è particolarmente utile per rilevare la tensione dei tessuti in vivo. Come dimostrato in questo protocollo, questo metodo può essere facilmente combinato con l'inattivazione della contrattilità dell'actomiosina mediata da Opto-Rho1DN per studiare l'impatto diretto della contrattilità cellulare dipendente da Rho1 sulla meccanica tissutale durante il rimodellamento dinamico dei tessuti.

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Protocol

1. Impostazione dell'incrocio genetico e preparazione del bicchiere per la raccolta degli ovuli

  1. Selezionare le femmine (vergini) della linea optogenetica UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) su un pad di CO2 sotto stereomicroscopio e allestito un incrocio con mosche maschi della linea driver GAL4 materna 67 Sqh-mCherry; 15 E-caderina-GFP.
    NOTA: Il 67 e il 15 stanno per Tubulina-GAL4 materna inserita rispettivamente nel secondo (II) e nel terzo (III) cromosomi52. La linea GAL4 utilizzata in questo protocollo esprime anche la catena leggera regolatrice della miosina marcata con mCherry Sqh (Spaghetti squash)37 e la E-caderina53 marcata con GFP. I moscerini della linea optogenetica possono ancora contenere cromosomi bilanciatori FM7 e TM6. I moscerini della linea materna GAL4 possono ancora contenere i cromosomi bilanciatori CyO e TM3.
  2. Dopo ~10 giorni, selezionare le femmine di mosca F1 con il seguente genotipo: UASp-CIBNpm/+; 67 mqCiliegio/+; 15 E-caderina-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry. Prepara una tazza per la raccolta delle uova con le mosche maschio.
    1. Assicurarsi che le femmine con il genotipo corretto non contengano cromosomi bilanciatori (cioè, non dovrebbero contenere ali arricciate [Cy], setole corte [Sb], occhi a forma di barra o rene [B] o setole omerali extra [Hu]), che sono marcatori per i bilanciatori CyO, TM3, FM7 e TM6 utilizzati rispettivamente per generare gli stock. Coprite la tazza con un piatto di succo di mela con una sfumatura di pasta di lievito fresco sulla superficie.
      NOTA: Nelle femmine F1, le componenti optogenetiche sono espresse per via materna. Pertanto, le femmine F1 utilizzate per l'allestimento della coppetta non devono necessariamente essere vergini. Si consiglia di utilizzare mosche maschi della stessa popolazione F1 per la tazza per comodità.
  3. Conservare la tazza in una scatola di cartone ricoperta da un foglio di alluminio per evitare ogni possibile dispersione di luce dall'ambiente. Cambiare il piatto del succo di mela ogni giorno per le tazze conservate a temperatura ambiente (~21-23 °C), o ogni due giorni per le tazze conservate a 18 °C.
    1. Immediatamente prima del cambio della piastra, battere la coppetta su una superficie piana (ad es. piano di lavoro) per mantenere le mosche sul fondo della coppetta e impedire loro di fuoriuscire. Cambia il piatto del succo di mela in una stanza buia e usa una lampada frontale con luce rossa per l'illuminazione (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: Per aumentare l'espressione dei costrutti che sono sotto il controllo della tubulina-GAL4 materna e dell'UASp, si raccomanda di mantenere la coppetta a 18 °C per almeno 3 giorni prima del prelievo dell'embrione. Questo periodo di incubazione consente inoltre alle mosche di adattarsi alla tazza e di essere ben nutrite con la pasta di lievito per ottenere una produzione ottimale di uova.

2. Raccolta degli embrioni nella fase desiderata e preparazione per la stimolazione optogenetica

NOTA: Tutte le fasi di raccolta e preparazione dei campioni devono essere eseguite in una stanza buia, utilizzando una "luce sicura" (ad es. luce rossa) per l'illuminazione. I componenti optogenici sono immensamente sensibili alla luce ambientale. Anche la minima esposizione alla luce ambientale porta a una stimolazione prematura del campione. In genere, le luci nell'intervallo verde-rosso (>532 nm) non causano stimoli indesiderati.

  1. Per la raccolta di embrioni all'inizio dell'embriogenesi, posizionare un nuovo piatto di succo di mela sulla tazza da 8 a 16 ore prima del prelievo degli embrioni (a 18 °C).
  2. Al momento del prelievo dell'embrione, cambiare il piatto del succo di mela. Etichettare la piastra staccata dalla tazza e coprire la superficie della piastra con un sottile strato di olio di alocarburi 27 (vedi Tabella dei materiali). Attendere 30-60 secondi affinché il guscio d'uovo diventi trasparente.
  3. Posizionare uno schermo di plastica rosso-arancio (vedi Tabella dei materiali) sul tavolino di uno stereoscopio verticale. Il posizionamento dello schermo rosso-arancione impedisce la stimolazione indesiderata durante l'illuminazione del campione, bloccando le lunghezze d'onda blu-verdi della luce trasmessa.
    NOTA: In questo protocollo, per la raccolta degli embrioni viene utilizzato uno stereoscopio verticale (vedi Tabella dei materiali).
  4. Posizionare il piatto di succo di mela sopra lo scudo rosso-arancio. Accendere la luce trasmessa dello stereomicroscopio per illuminare il campione. Raccogli 5-15 embrioni nella fase appropriata dal piatto di succo di mela usando un paio di pinzette. Non schiacciare gli embrioni con le pinzette.
    NOTA: In questo protocollo, l'embrione appropriato dovrebbe trovarsi nella fase di cellularizzazione medio-precoce. L'embrione in questa fase dovrebbe avere un tuorlo scuro opaco circondato da uno strato periplasmatico chiaro e uniforme che contiene le cellule del blastoderma in formazione. Il bordo d'attacco dei solchi di clivaggio ("fronte di cellularizzazione"), che appare come una linea continua parallela alla superficie dell'embrione, non dovrebbe passare la metà della profondità del periplasma.
  5. Tamponare delicatamente gli embrioni su un pezzo di carta assorbente (~1,5 cm × 1,5 cm) per rimuovere l'olio in eccesso dagli embrioni usando le pinzette.
  6. Aggiungere alcune gocce di candeggina al 40% appena preparata (~3% ipoclorito di sodio; vedere Tabella dei materiali) a un nuovo piccolo pezzo quadrato di carta assorbente (~1,5 cm × 1,5 cm) utilizzando una pipetta di plastica in modo che il tovagliolo di carta sia coperto da un sottile strato di candeggina. Trasferisci l'embrione dal tovagliolo di carta asciutto al tovagliolo di carta imbevuto di candeggina usando le pinzette e assicurati che gli embrioni siano imbevuti di candeggina. Attendere 2-4 minuti affinché l'embrione venga deborionato.
  7. Dopo la decorionazione, usa le pinzette per tamponare il tovagliolo di carta quadrato su un grande pezzo di carta velina per rimuovere la candeggina in eccesso. Assicurarsi che il lato con gli embrioni sia rivolto verso l'alto.
  8. Per risciacquare gli embrioni, utilizzare le pinzette per immergere delicatamente il tovagliolo di carta quadrato in una goccia di acqua deionizzata e tamponarlo rapidamente su un grande pezzo di carta velina. Ripetere questo processo otto volte per garantire la rimozione di eventuali residui di candeggina.
  9. Usa uno strumento per ciglia per trasferire l'embrione dal tovagliolo di carta a un piatto con fondo di vetro da 35 mm (vedi Tabella dei materiali). Aggiungere acqua deionizzata nel piatto per coprire interamente gli embrioni. Regola con precisione la posizione e l'orientamento degli embrioni utilizzando lo strumento ciglia.
    NOTA: Dopo la decorionazione, l'embrione tende ad attaccarsi alla superficie del vetro ed è immobile senza perturbazioni, quindi non è necessario applicare un trattamento aggiuntivo (come la colla) per immobilizzare l'embrione sul piatto con fondo di vetro.
  10. Posizionare il piatto con fondo in vetro da 35 mm con gli embrioni all'interno di una scatola nera a prova di luce (vedere la tabella dei materiali) per proteggere il campione dall'esposizione alla luce durante il processo di trasferimento. Porta la scatola nella stanza con il microscopio multifotone.

3. Stimolazione optogenetica, ablazione laser e imaging dell'embrione

NOTA: Il sistema multifotone utilizzato in questo esperimento (vedi Tabella dei materiali) è in grado di eseguire simultaneamente l'imaging a doppia lunghezza d'onda. Contiene anche un'unità di fotostimolazione con un laser a 458 nm e uno scanner galvanometrico separato, che consente la fotoattivazione/stimolazione all'interno di una regione di interesse (ROI) definita. Da notare che il laser a 920 nm, che viene utilizzato per eccitare le proteine fluorescenti verde-giallo, stimolerà Opto-Rho1DN, anche se più lentamente rispetto alla stimolazione mediata dal laser blu.

  1. Coprire il microscopio multifotone con un panno nero resistente alla luce (vedere la tabella dei materiali) per evitare stimolazioni indesiderate degli embrioni durante la preparazione del campione e l'imaging.
    NOTA: Lo stesso approccio viene utilizzato durante l'imaging multifotone regolare per proteggere i rivelatori sensibili alla luce equipaggiati sul microscopio.
  2. Spegni la luce della stanza e gli schermi del computer. Spegnere il controller del pannello a sfioramento facendo clic su OFF in "Retroilluminazione del controller del pannello a sfioramento" nel software. Assicurarsi che non ci sia altra luce ambientale nella stanza.
    1. Aprire il lato anteriore del coperchio in tessuto nero del microscopio. Prendi il piatto con fondo in vetro da 35 mm dalla scatola nera e posizionalo sul tavolino del microscopio.
  3. Illuminare gli embrioni con una luce verde normalmente utilizzata come luce di eccitazione per l'epifluorescenza. Per fare ciò, accendi l'unità di illuminazione a fluorescenza, seleziona Oculare sotto il pannello "Oculare" nel software e cambia la "Torretta del cubo" in 4:TRITC. Utilizzare l'oculare per identificare l'embrione di interesse e metterlo a fuoco.
    NOTA: La visualizzazione della luce verde si ottiene consentendo a una luce bianca generata dall'unità di illuminazione a fluorescenza di passare attraverso un cubo di filtro TRITC standard integrato, che contiene un filtro di eccitazione da 528-553 nm, un divisore di fascio da 565 nm e un filtro di emissione da 590-650 nm. Anche altre luci non blu dovrebbero funzionare bene per l'illuminazione del campione. Non è necessario indossare una protezione per gli occhi in questa fase, poiché la luce di eccitazione ha una bassa intensità e non sarà diretta verso l'oculare. L'embrione apparirà uniformemente rosso a causa dell'autofluorescenza.
  4. Chiudere il coperchio di stoffa nera in modo che il campione sia completamente protetto dalla luce. Accendere lo schermo del computer per accedere al software che controlla il microscopio. Cambiare l'"Oculare" in LSM nel software per l'acquisizione delle immagini.
  5. Eseguire l'ablazione laser in embrioni controllati e non stimolati utilizzando un obiettivo a immersione in acqua 25x.
    1. Fare clic su Bright Z, Sequence Manager e LSM Stimulation dalla "Finestra degli strumenti" nel software. Impostare il tipo di scanner come Galvano e il formato di scansione come 512 × 512. Accendere CH1 e CH3 nel pannello "Impostazione PMT" per consentire l'uso del laser a 1.040 nm e fare clic su Live × 4 per visualizzare l'embrione.
    2. Ruotare l'embrione utilizzando la funzione Rotazione nel software in modo che l'asse antero-posteriore dell'embrione sia orientato verticalmente. Impostare lo zoom su 3. Disegna una regione di interesse (ROI) utilizzando lo strumento forma in "Impostazioni scansione" e imposta la dimensione del ROI nel pannello "Riferimento". Impostare il ROI su 512 pixel in larghezza e 100 pixel in altezza (171 × 33 μm2).
    3. Impostare i parametri di acquisizione per lo Z-stack di pre-ablazione.
      1. Registrare la superficie dell'embrione come 0 nella "Sezione Z". Impostare l'inizio su 0 e la fine su 100 μm. Impostare la dimensione del passo su 2 μm. Attivare la modalità di acquisizione Z selezionando Z nella scheda "Serie".
      2. Impostare l'intensità del laser a 1.040 nm per aumentare linearmente dal 3% al 7% utilizzando la funzione Bright Z .
      3. Salvare l'impostazione di imaging corrente come prima attività della pipeline facendo clic su LSM in 'Sequence Manager'.
        NOTA: La pila Z pre-ablazione viene ottenuta per confermare lo stadio dell'embrione. In questo esperimento, CRY2-Rho1DN-mCherry e Sqh-mCherry saranno eccitati dal laser a 1.040 nm. Durante la costrizione apicale, il segnale Sqh-mCherry è potenziato nella regione medioapicale delle cellule mesodermiche ventrali, mentre CRY2-Rho1DN-mCherry è citosolico prima della stimolazione. L'intensità del laser impiegata per l'imaging pre e post-stimolazione viene decisa empiricamente in base all'equilibrio tra il rapporto segnale/rumore ottimale e l'evitare il fotosbiancamento.
    4. Impostare i parametri di acquisizione per il filmato di pre-ablazione.
      1. Eliminare qualsiasi ROI esistente per consentire l'imaging dell'intera regione di 512 × 512 pixel (171 × 171 μm 2, zoom 3x) vicino alla superficie ventrale dell'embrione, come descritto al punto 3.5.2. Impostare l'intensità del laser da 1.040 nm al 3%.
      2. Seleziona Ora e deseleziona Z nel pannello "Serie". Mantieni l'"Intervallo" come FreeRun sotto il pannello "Time Lapse". Impostare il ciclo come 10.
      3. Salvare le impostazioni correnti come attività successiva della pipeline facendo clic su LSM in 'Sequence Manager'.
        NOTA: Lo scopo di questa attività è quello di ottenere un filmato di pre-ablazione di un singolo piano Z di 10 fotogrammi con un laser da 1.040 nm per l'acquisizione dell'immagine. La velocità di acquisizione dell'immagine è di circa 1 s per fotogramma.
    5. Impostare i parametri per l'ablazione laser.
      1. Definire una regione 3D da immediatamente sotto la membrana vitellina a ~20 μm di profondità per l'ablazione laser (Figura 1A). Impostare l'inizio della pila Z come piano immediatamente sotto la membrana vitellina e l'estremità come 20 μm più profondo del piano iniziale. Impostare la dimensione del passo su 1,5 μm.
        NOTA: Il ROI della regione ablata è di ~30 pixel in larghezza e ~10 pixela in altezza (~10 μm lungo l'asse mediale-laterale e ~3,3 μm lungo l'asse A-P). Lo scopo dell'ablazione del campione su più piani Z è quello di garantire l'ablazione della superficie apicale delle cellule ventrali. Ciò è particolarmente importante per gli embrioni stimolati, poiché le cellule ventrali sperimentano un rapido rilassamento apicale dopo l'inibizione di Rho1.
      2. Accendere CH2 e CH4 sotto il pannello "Impostazione PMT" per consentire l'uso del laser a 920 nm. Impostare l'intensità del laser a 920 nm al 30%. Impostare l'acquisizione dell'immagine con il laser a 920 nm per un singolo Z-stack all'interno della regione 3D definita al punto 3.5.5.1 per l'ablazione laser.
        NOTA: L'intensità del laser scelta in questa fase è sufficiente per ablare il tessuto (come indicato dal rinculo del tessuto subito dopo il trattamento laser) ma nel frattempo non danneggia ovviamente la membrana plasmatica (come indicato dall'assenza di segni di bruciatura sulla membrana cellulare) (Figura 1B,C).
      3. Salvate l'impostazione corrente come attività successiva della pipeline facendo clic su LSM in 'Sequence Manager'.
    6. Impostare i parametri di acquisizione per il filmato post-ablazione.
      1. Imposta l'acquisizione delle immagini per un filmato post-ablazione di un singolo piano Z da 100 fotogrammi utilizzando i laser da 1.040 nm e 920 nm. Impostare l'intensità del laser a 1.040 nm e del laser a 920 nm rispettivamente al 3% e allo 0,3%. L'area specificata al punto 3.5.4 verrà ripresa con la stessa velocità di acquisizione dell'immagine.
      2. Salvate l'impostazione corrente come attività successiva della pipeline facendo clic su LSM in 'Sequence Manager'.
        NOTA: Lo scopo della memorizzazione dei parametri descritti nei passaggi 3.5.3-3.5.6 come attività sequenziali in 'Sequence Manager' prima di qualsiasi acquisizione effettiva è quello di garantire l'acquisizione della risposta tissutale immediata dopo l'ablazione laser.
    7. Seleziona Sequenza in "Acquisisci". Modificare il percorso di salvataggio dei dati e il nome del file in base alle esigenze. Fare clic su Pronto e attendere che il software inizializzi la pipeline. Quindi fare clic su Avvia per eseguire la pipeline.
  6. Eseguire l'ablazione laser in embrioni stimolati.
    1. Impostare i parametri di acquisizione per lo Z-stack di pre-ablazione, come descritto nei passaggi 3.5.1-3.5.3. Salvate l'impostazione corrente come prima attività della pipeline facendo clic su LSM in 'Sequence Manager'.
    2. Impostare i parametri per la stimolazione optogenetica all'interno di un ROI definito.
      1. Impostare lo zoom su 1 e selezionare una ROI che copra la superficie ventrale dell'embrione (~512 × 300 μm2). Spegnere i rilevatori CH1-CH4 .
      2. Fare clic su Stimolazione LSM. Deseleziona Continuo all'interno di Durata e digita 12 s. Controllare i 458 nm con un'intensità laser dello 0,3%.
      3. Salvare l'impostazione corrente come attività successiva della pipeline facendo clic su Stimolazione in "Sequence Manager".
        NOTA: Una stimolazione più rapida può essere ottenuta aumentando l'intensità del laser a 458 nm. Tuttavia, quando si utilizzano intensità laser più elevate, la luce laser diffusa può stimolare la regione adiacente al ROI, il che non è l'ideale se è richiesta una stimolazione spazialmente limitata.
    3. Impostare un tempo di attesa di 3 minuti dopo la stimolazione per garantire l'inattivazione totale della miosina e lo smontaggio della F-actina apicale e per ottenere una morfologia tissutale statica prima dell'ablazione laser. Ciò si ottiene facendo clic su Attesa /Pausa in "Sequence Manager" e impostando il tempo desiderato per "Attesa".
      NOTA: Il reclutamento di CRY2-Rho1DN-mCherry sulla membrana causato da un singolo ciclo di stimolazione (laser 0,3% a 458 nm per 12 s) è chiaramente rilevabile 10-15 minuti dopo la stimolazione. Questo è in linea con l'intervallo di dissociazione pubblicato di ~9 min47.
    4. Impostare i parametri di acquisizione per il filmato di pre-ablazione del singolo piano Z, come descritto al punto 3.5.4, ad eccezione del fatto che per l'acquisizione delle immagini vengono utilizzati sia i laser da 1.040 nm che quelli da 920 nm. Accendere i rilevatori CH1-CH4 . Impostare l'intensità del laser a 1.040 nm e del laser a 920 nm rispettivamente al 3% e allo 0,3%. Salvate l'impostazione corrente come attività successiva della pipeline facendo clic su LSM in 'Sequence Manager'.
    5. Impostare i parametri per l'ablazione laser, come descritto al punto 3.5.5. Salvate l'impostazione corrente come attività successiva della pipeline facendo clic su LSM in 'Sequence Manager'.
    6. Impostare i parametri di acquisizione per il singolo filmato post-ablazione del piano Z, come descritto al punto 3.5.6. Salvate l'impostazione corrente come attività successiva della pipeline facendo clic su LSM in 'Sequence Manager'.
    7. Seleziona Sequenza in "Acquisisci". Modificare il percorso di salvataggio dei dati e il nome del file in base alle esigenze. Fare clic su Pronto e attendere che il software inizializzi la pipeline. Quindi, fare clic su Avvia per eseguire la pipeline.

4. Quantificazione del tasso di rinculo dei tessuti dopo l'ablazione laser

  1. Aprire il filmato post-ablazione in ImageJ.
  2. Disegna un piccolo ROI lungo la linea mediana ventrale che copre la regione ablata utilizzando lo strumento Selezione rettangolo . La larghezza del ROI è di nove pixel. L'altezza del ROI è impostata in modo tale che il ROI sia abbastanza grande da coprire l'intera gamma di rinculo del tessuto dopo l'ablazione laser.
    1. Fai clic su Duplica nella scheda "Immagine". Nella finestra pop-up, seleziona Duplica stack e quindi fai clic su OK per duplicare lo stack all'interno del ROI selezionato.
  3. Genera un montaggio dalla pila duplicata tramite Immagini > Pile > Crea montaggio. Nella finestra popup, imposta il numero di riga su 1 e il numero di colonna sul numero totale di fotogrammi nella pila (100 in questo caso).
  4. Misurare la larghezza A-P della regione ablata nel tempo dal montaggio generato.
    1. Usate lo strumento Multipunto in ImageJ per contrassegnare i contorni A-P dell'area ablata per ogni punto temporale del montaggio.
    2. Salvare le coordinate dei punti contrassegnati utilizzando File > Salva con nome > Coordinate XY.
    3. Importa le coordinate XY misurate in MATLAB. Calcolare la larghezza A-P dell'area ablata per ogni punto temporale sottraendo la coordinata Y del limite superiore dalla coordinata Y del limite inferiore.
  5. Determina la velocità di rinculo del tessuto inserendo i primi 20 s della curva "larghezza nel tempo" in una linea utilizzando la funzione "polyfit" in MATLAB. Riportare la pendenza della linea adattata come la velocità di rinculo del tessuto.
  6. Eseguire test statistici per confrontare il tasso di rinculo tissutale tra i campioni stimolati e non stimolati.
    NOTA: Si raccomanda di ottenere dati da almeno cinque embrioni per condizione. Sia il test della somma dei ranghi di Wilcoxon a due lati che il test t degli studenti a due lati possono essere utilizzati per il confronto statistico.

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Representative Results

Negli embrioni non stimolati sottoposti a costrizione apicale, Sqh-mCherry si è arricchito nella regione medioapicale delle cellule mesodermiche ventrali, mentre CRY2-Rho1DN-mCherry era citosolico (Figura 1A). L'ablazione laser all'interno del dominio di costrizione ha portato a un rapido rinculo del tessuto lungo l'asse A-P (Figura 1B,C). Negli embrioni stimolati, il segnale CRY2-Rho1DN-mCherry è diventato localizzato sulla membrana plasmatica, mentre il segnale medioapicale di Sqh-mCherry è completamente scomparso (Figura 1A). L'ablazione laser negli embrioni stimolati non ha provocato un evidente rinculo dei tessuti, come esemplificato nella Figura 1B,C e quantificato nella Figura 1D. Questi risultati indicano che la generazione di tensione tissutale richiede una contrattilità apicale attiva dell'attomiosina; quando l'actomiosina diventa inattiva in seguito all'inibizione di Rho1, anche la tensione del tessuto apicale diminuisce41. Queste osservazioni sono coerenti con i risultati precedenti secondo cui l'attivazione della contrattilità apicale della miosina nelle cellule mesodermiche ventrali provoca un aumento della tensione tissutale sulla superficie ventrale dell'embrione40.

Figure 1
Figura 1: La stimolazione Opto-Rho1DN durante la costrizione apicale provoca un'immediata perdita di tensione corticale sulla superficie ventrale dell'embrione . (A) Cartone animato raffigurante la configurazione sperimentale per l'ablazione laser per rilevare la tensione corticale. Le regioni ombreggiate in giallo indicano le regioni ablate. Per gli embrioni stimolati, l'attivazione alla luce di Opto-Rho1DN è stata eseguita 3 minuti prima dell'ablazione laser. A causa del rilassamento apicale dopo la stimolazione, sono stati ablati più piani z (regione ombreggiata in giallo) al fine di garantire l'ablazione della superficie apicale delle cellule ventrali. (B,C) Confronto tra embrioni non stimolati e stimolati. Non è stato osservato alcun evidente rinculo tissutale negli embrioni stimolati (N = 6 per gli embrioni non stimolati e N = 5 per gli embrioni stimolati). (B) Vista frontale degli embrioni sottoposti ad ablazione laser. I riquadri ombreggiati in giallo contrassegnano la regione ablata. (C) Kymografi che rappresentano la variazione di larghezza della regione ablata. Le linee tratteggiate gialle indicano il sito di ablazione. (D) Variazioni di larghezza della regione ablata lungo l'asse A-P durante i primi 20 s dopo l'ablazione laser. È stato osservato un chiaro rinculo del tessuto dopo il taglio laser negli embrioni di controllo non stimolati. Al contrario, negli embrioni stimolati è stato osservato un rinculo dei tessuti minimo o nullo, indicando una mancanza di tensione apicale dopo l'inibizione di Rho1. La barra di errore è la deviazione standard. Il valore p è stato calcolato utilizzando un test di somma del rango di Wilcoxon a due lati. Questa figura è riutilizzata da Guo et al.41. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo descriveva l'uso combinato dell'optogenetica e dell'ablazione laser per sondare i cambiamenti nella tensione tissutale immediatamente dopo l'inattivazione della contrattilità dell'actomiosina. Lo strumento optogenetico qui descritto sfrutta la forma negativa dominante di Rho1 (Rho1DN) per inibire in modo acuto la contrattilità endogena dell'actomiosina Rho1 e Rho1-dipendente. Una precedente caratterizzazione di Opto-Rho1DN nel contesto della formazione di solchi ventrali di Drosophila ha dimostrato che lo strumento è altamente efficace nel mediare la rapida inattivazione della contrattilità apicale dell'actomiosina attraverso l'inattivazione simultanea della miosina e il disassemblaggio dell'actina41. In particolare, la stimolazione degli embrioni al momento della costrizione apicale ha portato a una riduzione del segnale della miosina apicale entro 60 s nelle cellule sottoposte a costrizione apicale41. Questa rapida rimozione della miosina corticale dopo l'inibizione di Rho1 è probabilmente dovuta al ciclo veloce di Rho1 e miosina attraverso stati attivi e inattivi, causato dalle attività delle proteine attivanti la GTPasi (GAPs) per Rho1 e le fosfatasi a catena leggera della miosina, rispettivamente19,54. Coerentemente con l'impatto sull'actomiosina, l'accoppiamento dell'optogenetica con l'ablazione laser ha dimostrato che la stimolazione Opto-Rho1DN durante la costrizione apicale ha provocato un'immediata perdita di tensione epiteliale nella regione ventrale dell'embrione41 (Figura 1). Questo approccio combinato ci ha permesso di studiare la funzione della contrattilità cellulare mediata da Rho1 nella regolazione della meccanica tissutale con una precisione spaziale e temporale senza precedenti, rendendo possibile sezionare gli impatti immediati degli effetti a lungo termine che sono difficili da ottenere utilizzando approcci genetici convenzionali.

Un'importante considerazione tecnica quando si utilizza Opto-Rho1DN è che lo strumento è altamente sensibile alla luce ambientale. Un problema comunemente riscontrato nell'esperimento è il reclutamento di CRY2-mCherry-Rho1DN sulla membrana plasmatica prima della fase di stimolazione, che è tipicamente causato dalla stimolazione prematura del campione durante una delle seguenti fasi: preparazione del campione, trasferimento del campione nella sala del microscopio, posizionamento del campione sul tavolino del microscopio e acquisizione dell'immagine di pre-stimolazione. Nel nostro protocollo, vengono impiegate diverse procedure per prevenire la stimolazione indesiderata, tra cui la manipolazione delle coppette di mosca e degli embrioni in una stanza buia sotto luce rossa, il filtraggio delle lunghezze d'onda blu dalla luce di illuminazione durante la selezione e il montaggio degli embrioni sotto lo stereomicroscopio e l'evitare l'esposizione degli embrioni a un laser da 400-500 nm (eccitazione a singolo fotone) o a un laser pulsato da 830-980 nm (eccitazione multifotone) prima della stimolazione. È fondamentale prestare particolare attenzione in più fasi dell'esperimento per evitare stimolazioni indesiderate del campione. Inoltre, quando si utilizza Opto-Rho1DN per inibire Rho1 all'interno di una specifica regione di interesse (ROI) nell'embrione41, si raccomanda di utilizzare l'intensità laser più bassa in grado di ottenere una robusta traslocazione di CRY2-Rho1DN sulla membrana plasmatica. Poiché Opto-Rho1DN è estremamente sensibile alle lunghezze d'onda blu, un laser blu ad alta intensità può provocare una stimolazione indesiderata nelle cellule al di fuori del ROI o anche negli embrioni vicini a causa della luce diffusa.

Nella sua versione attuale, lo strumento Opto-Rho1DN presenta diverse limitazioni. In primo luogo, per gli esperimenti descritti in questo protocollo, è stata utilizzata un'ancora CIBN localizzata sulla membrana plasmatica per reclutare CRY2-Rho1DN attivato dal citosol alla membrana plasmatica41,47. Con questo disegno, è difficile eseguire l'inibizione confinata di Rho1 all'interno di uno specifico dominio di membrana plasmatica a causa della diffusione delle proteine CRY2-Rho1DN attivate nel citosol. Un ulteriore miglioramento della precisione spaziale su scala subcellulare attende lo sviluppo di nuove ancore CIBN che abbiano modelli di localizzazione subcellulare più specifici. In secondo luogo, Opto-Rho1DN è progettato per inibire Rho1 durante l'embriogenesi precoce. L'espressione di CIBNpm e CRY2-Rho1DN-mCherry è controllata da UASp, che è standardizzato per l'espressione nelle linee germinali femminili 55. L'espressione di questi moduli nei tessuti somatici oltre l'embriogenesi precoce può richiedere la sostituzione di UASp con un promotore più efficace per guidare l'espressione somatica (ad esempio, UASt56). Infine, l'efficacia di Opto-Rho1DN dipende dall'abbondanza dell'ancora CIBN e delle proteine CRY2-Rho1DN. Nella versione attuale dello strumento, è determinato dalla linea di driver GAL4 utilizzata per guidare l'espressione dei moduli optogenetici. Quando si utilizza il driver GAL4 materno descritto in questo protocollo, è fondamentale utilizzare la linea che fornisce due copie del gene GAL4 (ad esempio, sia 67 che 15) al fine di ottenere la rapida e potente inibizione della contrattilità dell'actomiosina. La riduzione del numero di copie di GAL4 materno nelle femmine F1 da due a uno ha ridotto significativamente l'effetto inibitorio.

Rispetto agli approcci genetici convenzionali, l'approccio optogenetico descritto in questo protocollo è vantaggioso per sezionare lo stadio e la funzione tessuto-specifica di Rho1 negli embrioni precoci di Drosophila. La funzione di Rho1 nell'embriogenesi precoce di Drosophila è in gran parte soddisfatta dal prodotto genico caricato maternamente11. L'esaurimento di Rho1 blocca maternamente l'oogenesi57, impedendo lo studio della sua funzione durante l'embriogenesi precoce. Negli ultimi anni, sono stati sviluppati diversi strumenti optogenetici per regolare l'attività endogena di Rho1 negli embrioni di Drosophila. Sia Izquierdo et al. che Rich et al. hanno sviluppato strumenti optogenetici per attivare l'attività di Rho1 regolando la localizzazione del dominio catalitico di Rho GEFs in embrioni di Drosophila 48,58. Inoltre, Herrera-Perez et al. hanno sviluppato due strumenti optogenetici che utilizzano RhoGEF2 a lunghezza intera (optoGEF) o C-GAP a lunghezza intera (optoGAP) per attivare o inibire l'attività endogena di Rho1,rispettivamente. Poiché optoGAP funziona reclutando un GAP Rho1 sulla membrana plasmatica, la sua applicazione può essere sensibile alla presenza di GEF Rho1 endogeni, che possono compensare o addirittura annullare l'effetto del reclutamento ectopico del GAP. Al contrario, sequestrando direttamente i GEF di Rho1, Opto-Rho1DN può fornire un modo più robusto per inibire la contrattilità endogena dell'actomiosina Rho1 e Rho1-dipendente.

Data l'ampia gamma di funzioni di Rho1 nell'embriogenesi e nello sviluppo post-embrionale, il protocollo presentato può essere facilmente adattato per studiare la funzione delle riorganizzazioni cellulari Rho1 e Rho1-dipendenti in una vasta gamma di processi morfogenetici. Inoltre, una strategia simile può, in linea di principio, essere utilizzata per limitare severamente altre piccole GTPasi, come le GTPasi della famiglia Rho Cdc42 e Rac, poiché le loro forme dominanti negative sono state ampiamente utilizzate per inibire la funzione endogena di queste proteine11. Infine, come esemplificato in questo protocollo, la combinazione di approcci di optogenetica e ablazione laser può fornire un modo efficace per studiare l'impatto immediato dell'inattivazione di una proteina specifica sulla dinamica e sulla meccanica tissutale, che ci porterà nuove intuizioni sulla morfogenesi tissutale che sono difficili da scoprire utilizzando approcci genetici convenzionali.

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Disclosures

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Ann Lavanway per il supporto all'imaging. Gli autori ringraziano il laboratorio Wieschaus e il laboratorio De Renzis per la condivisione dei reagenti e il Bloomington Drosophila Stock Center per gli stock di mosche. Questo studio è supportato da NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 e American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 a BH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation

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References

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Biologia dello sviluppo Numero 194 optogenetica meccanica tissutale Rho1 actomiosina ablazione laser costrizione apicale gastrulazione
Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di <em>Drosophila</em>
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Guo, H., Swan, M., He, B.… More

Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).

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