Channelrhodopsin2 vermittelte Stimulation der synaptischen Potentiale an Drosophila Neuromuskulären Endplatten
Summary
Bei diesem Verfahren wird ein blaues Licht aktiviert Algen Kanal-und Zell-spezifische genetische Expression Tools zur synaptischen Potentiale mit Lichtimpulsen evozieren an der neuromuskulären Synapse (NMJ) in<em> Drosophila</em> Larven. Diese Technik ist eine kostengünstige und einfach zu bedienende Alternative zu Saugelektrode Stimulation für die synaptische Physiologie Studien in Forschung und Lehre Labors.
Abstract
Die<em> Drosophila</em> Larvalen neuromuskulären Vorbereitung hat sich als ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung synaptischer Physiologie<sup> 1,2,3</sup>. Derzeit ist das nur für exzitatorische junctional Potentiale (EJPs) in dieser Zubereitung auslösen beinhaltet die Verwendung von Saug-Elektroden. In Forschung und Lehre Labore, Studenten haben oft Schwierigkeiten, Rangieren und manipulieren diese Art der stimulierenden Elektrode. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir, wie aus der Ferne zu stimulieren synaptischen Potentiale an den Larven NMJ ohne den Einsatz von Saug-Elektroden. Durch die Expression Channelrhodopsin2 (ChR2)<sup> 4,5,6</sup> In<em> Drosophila</em> Motoneuronen mit dem<em> GAL4-UAS</em> System<sup> 7</sup>, Und kleinere Änderungen an einer grundlegenden Elektrophysiologie rig, konnten wir zuverlässig wecken EJPs mit Impulsen von blauem Licht. Diese Technik könnte von besonderem Nutzen in der Neurophysiologie Lehre Labors, in denen Schüler rig Praxis Zeit und Ressourcen sind begrenzt.
Protocol
Discussion
Kritische Schritte umfassen sowohl die ursprüngliche Dissektion und das Eintreten von Muskelzellen. Wenn die Nerven abgeschnitten werden oder Muskel beschädigt ist während der ersten Sektion ist es schwierig, den Rest das Experiment fortzusetzen. Während Dissektion, muss man sehr vorsichtig sein, um Winkel Präparierscheren nach oben so viel wie möglich während der dorsale Inzision. Während der zweite entscheidende Schritt in eine Muskelzelle, muss man für eine Hyperpolarisation letzten ~ 30 mV zu beobachten. We…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewährt RO1GM-33205 und MH-067284 zu LC Griffith und durch eine Brandeis University Sommer Undergraduate Research Stipendium NJ Hornstein unterstützt. In Woods Hole, MA: Erste Experimente für diese Technik wurden am Marine Biological Laboratory im Rahmen des 2008 Neural Systems and Behavior Sommerkurs (R25 MH059472 NIMH Zuschuss) durchgeführt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| Sylgard | Ellsworth adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com | |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com | |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | ||
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com | |
| Powerlab 4/30 data acquisition system | AD instruments | www.adinstruments.com | ||
| Grass stimulator | Grass instruments | www.grasstechnologies.com | ||
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | ||
| Dissecting Scope | Leica | www.leica-microsystems.com | ||
| Light Source | Dolan-Jenner | 41446-062 | www.dolan-jenner.com | |
| Fly Media | ||||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com | |
| OK-371 Gal4 Flies | Aberle lab, Griffith lab, Bloomington stock center | |||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | |||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
||
| LED Heat Sink | Thor Labs | http://www.thorlabs.com/ | ||
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | ||
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | |||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Leitz | ACS01 | www.leica-microsystems.com | |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | ||
| Borosilicate Glass | FHC | www.fh-co.com/p14-15.pdf | ||
| Electrode Puller | Sutter Instruments | www.sutter.com | ||
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
|||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
References
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- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279 (2005).
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