Channelrhodopsin2 stimolazione mediata dei potenziali Synaptic a Drosophila Giunzioni neuromuscolari
Summary
Questa procedura utilizza una luce blu-attivati canali delle cellule algali e strumenti specifici per l'espressione genetica di evocare i potenziali sinaptici con impulsi di luce a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ) in<em> Drosophila</em> Larve. Questa tecnica è un poco costoso e facile da usare alternativa alla stimolazione dell'elettrodo di aspirazione per gli studi di fisiologia sinaptica nella ricerca e laboratori didattici.
Abstract
Il<em> Drosophila</em> Larvale preparazione neuromuscolare ha dimostrato di essere uno strumento utile per studiare la fisiologia sinaptica<sup> 1,2,3</sup>. Attualmente, l'unico mezzo a disposizione per evocare i potenziali eccitatori giunzionale (EJPs) in questa preparazione prevede l'utilizzo di elettrodi di aspirazione. In entrambi i laboratori di ricerca e di insegnamento, gli studenti spesso hanno difficoltà a manovrare e manipolare questo tipo di elettrodo stimolante. Nel presente lavoro, mostriamo come stimolare a distanza i potenziali sinaptici alla larvale NMJ senza l'uso di elettrodi di aspirazione. Esprimendo channelrhodopsin2 (ChR2)<sup> 4,5,6</sup> In<em> Drosophila</em> Motoneuroni utilizzando il<em> GAL4-UAS</em> Sistema<sup> 7</sup>, E fare piccole modifiche ad un impianto di base di elettrofisiologia, siamo stati in grado di evocare affidabile EJPs con impulsi di luce blu. Questa tecnica potrebbe essere particolarmente utile nei laboratori didattici neurofisiologia dove rig studente a tempo pratica e le risorse sono limitate.
Protocol
Discussion
Passaggi critici coinvolgono sia la dissezione iniziale e l'ingresso delle cellule muscolari. Se i nervi vengono tagliati o muscolo viene danneggiato durante la dissezione iniziale è difficile continuare il resto della sperimentazione. Durante la dissezione, bisogna stare molto attenti a sezionare le forbici angolo verso l'alto il più possibile durante l'incisione dorsale. Durante il secondo passo fondamentale, entrando in una cellula muscolare, si deve guardare per un passato iperpolarizzazione ~ 30 mV. I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of concede Salute RO1GM-33205 e MH-067284-LC Griffith e da una borsa di studio estiva Brandeis di ricerca dell'Università di laurea a New Jersey Hornstein. Esperimenti preliminari per questa tecnica sono stati eseguiti presso il Marine Biological Laboratory come parte del 2008 e l'estate dei sistemi neurali corso Behavior (NIMH sovvenzione: R25 MH059472) in Woods Hole, Massachusetts.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| Sylgard | Ellsworth adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com | |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com | |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | ||
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com | |
| Powerlab 4/30 data acquisition system | AD instruments | www.adinstruments.com | ||
| Grass stimulator | Grass instruments | www.grasstechnologies.com | ||
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | ||
| Dissecting Scope | Leica | www.leica-microsystems.com | ||
| Light Source | Dolan-Jenner | 41446-062 | www.dolan-jenner.com | |
| Fly Media | ||||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com | |
| OK-371 Gal4 Flies | Aberle lab, Griffith lab, Bloomington stock center | |||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | |||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
||
| LED Heat Sink | Thor Labs | http://www.thorlabs.com/ | ||
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | ||
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | |||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Leitz | ACS01 | www.leica-microsystems.com | |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | ||
| Borosilicate Glass | FHC | www.fh-co.com/p14-15.pdf | ||
| Electrode Puller | Sutter Instruments | www.sutter.com | ||
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
|||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
References
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- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72 (2007).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940 (2003).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741 (2006).
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- Ralph Greenspan, . . Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , (2004).
