Un metodo per l'incapsulamento follicolo ovarico e la cultura in un proteoliticamente degradabile 3 Sistema dimensionale
Summary
Un nuovo metodo per l'incapsulamento follicolo ovarico in una rete di fibrina-alginato 3D compenetrano è descritto. Questo sistema combina un sostegno strutturale con degradazione proteolitica per sostenere lo sviluppo dei follicoli immaturi per la produzione di ovociti maturi. Questo metodo può essere applicato agli aggregati di coltura cellulare per mantenere la cellula-cellula contatti senza limitare l'espansione.
Abstract
Il follicolo ovarico è l'unità funzionale dell'ovaio che secerne ormoni sessuali e supporta la maturazione degli ovociti. Follicolo Nelle tecniche in vitro fornire uno strumento per lo sviluppo del modello follicolo per studiare biologia di base, e sono ulteriormente sviluppata come una tecnica per preservare la fertilità del clinica 1-4. Il nostro sistema di coltura in vitro impiega idrogel in modo da simulare l'ambiente nativo ovarico, mantenendo l'architettura 3D follicolare, interazioni cellula-cellula e di segnalazione paracrina che lo sviluppo del follicolo diretta 5. In precedenza, i follicoli sono stati colti con successo in alginato, un inerte alghe polisaccaride derivato che subisce gelificazione con gli ioni calcio 6-8. Idrogel alginato formata ad una concentrazione di 0,25% w / v sono stati i più permissivi per la cultura follicolo, e mantenuto la massima competenza dello sviluppo 9. Idrogel alginato non sono degradabili e quindi un aumento del diametro del follicolo risultati in una forza di compressione sul follicolo che possono influenzare la crescita del follicolo 10. Successivamente abbiamo sviluppato un sistema di coltura basato su una rete di fibrina-alginato compenetrano (FA-IPN), in cui sono gelificato una miscela di fibrina e alginato contemporaneamente. Questa combinazione offre un ambiente dinamico meccanico perché entrambi i componenti contribuiscono alla rigidità matrice inizialmente, tuttavia, proteasi secreto dal follicolo crescente degrado fibrina nella matrice di alginato lasciando solo quello di fornire supporto. Con l'IPN, il contenuto alginato può essere ridotto al di sotto dello 0,25%, il che non è possibile con alginato solo 5. Così, come il follicolo si espande, si sperimenterà una forza di compressione ridotto a causa del ridotto contenuto di solidi. Qui, descriviamo un metodo di incapsulamento e di un sistema di coltura in vitro di follicoli ovarici in una FA-IPN. L'ambiente dinamico meccanico imita l'ambiente naturale in cui follicoli ovarici piccolo risiedono in una corteccia rigido e passare a un midollo più permissiva in quanto aumentano di dimensione 11. La componente degradabile può essere particolarmente critico per la traduzione clinica al fine di supportare il maggiore di 10 aumento di 6 volte il volume che i follicoli umani normalmente sottoposti in vivo.
Protocol
Discussion
Il metodo presentato follicolo ovarico incapsulamento in una FA-IPN consente cultura follicolo in un ambiente 3D in vitro. Un FA-IPN è un processo dinamico, cellula-reattiva matrice in cui sono determinati le proprietà iniziali meccaniche dalla combinazione di entrambi fibrina e alginato. Durante la cultura, il follicolo incapsulato attiva proteasi che degradano solo una componente del IPN, la fibrina, che si traduce in una rigidità gel gradualmente decrescente che ha contribuito unicamente dal alginato che …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal NIH (U54HD41857 e PL1EB008542, un P30 core Biomateriali all'interno del Consorzio Oncofertility tabella di marcia di sovvenzione).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fetuin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | F3385 | ||
| FBS | Invitrogen, Gibco | 10082-139 | ||
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | ||
| CaCl2 | Wako | 039-00475 | 40 mM | |
| EGF | Sigma | A412 | ||
| rFSH | A.F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases | |||
| hCG | Sigma | CG-5 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | A1603 | ||
| ITS | Sigma | I1884-1VL | ||
| L-15 | Gibco | 11415 | ||
| αMEM+Gluta MAX | Gibco | 32561 | ||
| Pen-Strep | Cellgro | 30-002-CI | ||
| TBS | Pierce | 28379 | ||
| Tisseel Fibrin kit | Baxter | 921030 | ||
| Sodium Alginate | FMC BioPolymers | LF200DL | Mw 418kDa |
References
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