Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis ​​3 Sistema Dimensional

Summary

Um novo método para encapsulação de ovário folículos em uma rede de fibrina 3D alginato-interpenetrantes é descrito. Este sistema combina suporte estrutural, com a degradação proteolítica para apoiar o desenvolvimento de folículos imaturos para produzir ovócitos maduros. Este método pode ser aplicado a agregados de cultura de células para manter contatos célula-célula sem limitar a expansão.

Abstract

O folículo ovariano é a unidade funcional do ovário que secreta hormônios sexuais e suporta maturação de oócitos. Em técnicas folículo vitro fornecer uma ferramenta para o desenvolvimento folicular modelo a fim de investigar a biologia básica, e são ainda a ser desenvolvido como uma técnica para preservar a fertilidade do clínica ^1-4. Nosso sistema de cultura in vitro emprega hidrogéis, a fim de imitar o ambiente nativo do ovário, mantendo a arquitetura folicular 3D, interações célula-célula e sinalização parácrina que o desenvolvimento folicular direta ^5. Anteriormente, os folículos foram cultivados com sucesso em alginato, um polissacarídeo derivado de algas inerte que sofre gelificação com íons de cálcio ^6-8. Hidrogéis de alginato formado em uma concentração de 0,25% w / v foram os mais permissiva para a cultura do folículo, e manteve a mais alta competência de desenvolvimento ^9. Hidrogéis de alginato não são biodegradáveis, portanto, um aumento nos resultados folículo de diâmetro em uma força de compressão sobre o folículo que podem impactar o crescimento do folículo ^10. Nós posteriormente desenvolvido um sistema de cultura baseado numa rede de fibrina alginato-interpenetrantes (FA-IPN), em que uma mistura de alginato de fibrina e são gelled simultaneamente. Esta combinação fornece um ambiente dinâmico mecânica, porque os dois componentes contribuem para a rigidez da matriz, inicialmente, no entanto, proteases secretadas pelo folículo crescente degradação de fibrina na matriz de alginato deixando apenas para prestar apoio. Com o IPN, o conteúdo de alginato pode ser reduzida abaixo de 0,25%, o que não é possível com alginato sozinho ^5. Assim, como o folículo se expande, ele vai experimentar uma força de compressão reduzida devido ao teor de sólidos reduzidos. Aqui, descrevemos um método de encapsulamento e um em sistema de cultura in vitro para folículos ovarianos em um FA-IPN. O ambiente dinâmico mecânico imita o ambiente natural em que ovário folículos pequenos residir em um córtex rígido e mover para uma medula mais permissiva à medida que aumentam de tamanho ^11. O componente degradável pode ser particularmente crítica para a tradução clínica, a fim de apoiar o maior aumento de 10 ⁶ vezes no volume que os folículos humano normalmente sofrem in vivo.

Protocol

1. Isolamento folículo Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e Uso Animal, instituído Institucional e protocolo de atendimento na Northwestern University. Para melhores resultados, todas as dissecções são realizadas em L15 de mídia para o controle de pH a níveis ambientais de CO 2, em 37 ° C estágio…

Discussion

O ovário apresenta método de encapsulamento em um folículo FA-IPN permite folículo cultura em um ambiente 3D in vitro. A FA-IPN é um processo dinâmico, a matriz de células de resposta em que as propriedades mecânicas iniciais são determinados pela combinação de ambos fibrina e alginato. Durante a cultura, o folículo encapsulado ativa proteases que degradam apenas um componente do IPN, a fibrina, que resulta em um gel, diminuindo gradualmente a rigidez que é contribuição apenas pelo alginato reman…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Fetuin		Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	F3385
FBS		Invitrogen, Gibco	10082-139
Aprotinin		Roche	10236624001
CaCl2		Wako	039-00475	40 mM
EGF		Sigma	A412
rFSH		A.F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
hCG		Sigma	CG-5
Hyaluronidase		Sigma	A1603
ITS		Sigma	I1884-1VL
L-15		Gibco	11415
αMEM+Gluta MAX		Gibco	32561
Pen-Strep		Cellgro	30-002-CI
TBS		Pierce	28379
Tisseel Fibrin kit		Baxter	921030
Sodium Alginate		FMC BioPolymers	LF200DL	Mw 418kDa