RNA<em> في الموقع</em> التهجين في الأجنة جبل الجامعة وعلم الأنسجة الخلية مقتبس عن Elasmobranchs البحرية
Summary
من خلال الجمع بين أساليب جبل RNA كله<em> في الموقع</em> التهجين وعلم الأنسجة، يمكن ربط التعبير الجيني لقرارات مصير الخلية في الجنين النامية. وقد تم تكييف هذه الأساليب لelasmobranchs البحرية وتسهيل استخدام هذه الحيوانات والكائنات الحية نموذجا للدراسات الطبية الحيوية، وعلم السموم والمقارنة.
Abstract
وتقدر قيمة elasmobranchs النماذج الحيوانية البحرية للدراسات الطب الحيوي والجينومية لأنها هي الفقاريات الأكثر بدائية لديهم مناعة التكيفية ولها آليات فريدة من نوعها لتنظيم التناضح 1-3. كما الفقاريات الفكية-المعيشة الأكثر بدائية مع الزوائد مقترن، elasmobranchs هي نموذجا هاما تطويريا، وخاصة بالنسبة للدراسات في التطور والتنمية. كما تم elasmobranchs البحرية تستخدم لدراسة علم السموم المائية وعلم وظائف الأعضاء التوتر في العلاقة إلى 4 تغير المناخ. وبالتالي، هناك حاجة إلى تطوير وتكييف المنهجيات لتسهيل وتوسيع نطاق استخدام هذه الفقاريات البدائية إلى التخصصات البيولوجية متعددة. هنا أقدم على التكيف الناجح لجبل RNA كله في الموقع التهجين والتقنيات النسيجية لدراسة التعبير الجيني وعلم الأنسجة الخلية في elasmobranchs.
رصد التعبير الجيني هو أداة مميزة لبيول التنمويةogists، ويستخدم على نطاق واسع للتحقيق في العمليات التنموية 5. RNA جبل بأكمله في الموقع التهجين يسمح التصور وتوطين النصوص جين معين في أنسجة الجنين النامية. يمكن للنمط التعبير الجيني في الرسالة توفير نظرة ثاقبة ما هي العمليات التنموية والقرارات مصير الخلية الجين قد السيطرة عليها. من خلال مقارنة نمط التعبير عن الجينات في مراحل نمو مختلفة، يمكن اكتسبت نظرة ثاقبة دور كيف لتغييرات الجين خلال التنمية.
بينما جبل كامل في ليالي 'الموقع يوفر وسيلة لتوطين التعبير الجيني للأنسجة، وتقنيات النسيجية تسمح لتحديد أنواع الخلايا والأنسجة المتمايزة. البقع النسيجية لها وظائف متنوعة. وتستخدم لتسليط الضوء على بقع العام شكل الخلية، على سبيل المثال hematoxylin و eosin لتلطيخ العام للنوى والسيتوبلازم، على التوالي. يمكن تسليط الضوء على بقع معينة من الخلايا الأخرىأنواع. على سبيل المثال، وصمة عار ذكرت والأزرق alcian في هذه الورقة هو وصمة عار على نطاق واسع لتحديد mucosaccharides الموجبة. يمكن تلطيخ من الجهاز الهضمي مع الأزرق alcian تحديد توزيع الخلايا الكأسية التي تنتج mucosaccharides. الاختلافات في مكونات mucosaccharide على الببتيدات قصيرة تمييز الخلايا الكأسية حسب الوظيفة في الجهاز الهضمي 6. باستخدام RNA جبل كامل في أساليب الموقع لوالنسيجية بشكل متزامن، يمكن ربط مصير قرارات الخلية إلى الجينات المحددة التعبير.
على الرغم من أن RNA في ليالي الموقع 'والكيمياء النسيجية وتستخدم على نطاق واسع من قبل الباحثين، والتقى تكييفها واستخدامها في elasmobranchs البحرية نجاحا محدودا ومتنوعة. هنا أقدم البروتوكولات التي وضعت لelasmobranchs واستخدامها على أساس منتظم في مختبري. على الرغم من أن قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التعديل من الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين طريقة لللتكيف مع أنواع مختلفة، وصفت البروتوكولات هنا عrovide نقطة قوية للباحثين الراغبين بدءا من التكيف على استخدام elasmobranchs البحرية على استفساراتهم العلمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكولات المقدمة من الطرق الكلاسيكية لرصد وتحديد التعبير الجيني أنواع الخلايا المتمايزة، والتي تم تكييفها للاستخدام في elasmobranchs البحرية. قد تكون هناك حاجة لإجراء المزيد من التعديلات هذه البروتوكولات على التكيف مع أنواع مختلفة صفيحية الخياشيم.
<p class="jove_content" styl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأود أن أشكر العديد من الطلاب الجامعية الذين عملوا في مختبري وساهم في تطور هذه البروتوكولات. وقد تلقت الدعم من NAT شبكة سكيدمور، الاتحاد، وهو مشروع إنشاء ADVANCE مع NSF المدفوعة المنحة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase – SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ‘s. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. |
References
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T., Shuttleworth, R. . Physiology of elasmobranch fishes. , 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217, 1214-1222 (1982).
- Ballatori, N., Villalobos, A. Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models. Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).
- Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).
- Jass, J. R., Walsh, M. D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review. J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).
- Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae). J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).
- Echelard, Y., et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell. 75, 1417-1430 (1993).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, 7.82 (2001).
- Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
- Theodosiou, N. A., Simeone, A. Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea. Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).
- Filipe, M. I. Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review. Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).
- Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria. Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).
- Reid, B. J., et al. Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett’s esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort. Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).
- Mowry, R. Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status. Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).
- Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development. 125, 2791-2801 (1998).
