RNA<em> In situ</em> Hybridisatie in Hele Mount Embryo's en histologie Aangepast voor Marine kraakbeenvissen
Summary
Door het combineren van methoden voor RNA whole mount<em> In situ</em> Hybridisatie en histologie kan genexpressie worden gekoppeld lot van de cel beslissingen in het ontwikkelende embryo. Deze methoden zijn aangepast aan de zee kraakbeenvissen en vergemakkelijken van het gebruik van deze dieren als modelorganismen voor biomedische, toxicologie en vergelijkende studies.
Abstract
Marine kraakbeenvissen worden gewaardeerd diermodellen voor biomedisch en genoomonderzoek studies zoals ze zijn de meest primitieve gewervelde dieren adaptieve immuniteit hebben en hebben unieke mechanismen voor osmoregulatie 1-3. Als de meest primitieve levende jawed-gewervelde dieren met gepaarde aanhangsels, kraakbeenvissen zijn een evolutionair belangrijk model, met name voor studies in de evolutie en ontwikkeling. Marine kraakbeenvissen zijn ook gebruikt voor aquatische toxicologie en stressfysiologie bestuderen in relatie tot klimaatverandering 4. Aldus wordt de ontwikkeling en aanpassing van methoden die nodig te vergemakkelijken en het gebruik van deze primitieve vertebraten uitbreiden meerdere biologische disciplines. Hier presenteer ik de succesvolle aanpassing van RNA whole mount in situ hybridisatie en histologische technieken om genexpressie en histologie in kraakbeenvissen bestuderen.
Monitoring genexpressie is een kenmerk instrument van ontwikkelingsstoornissen biologists is en veel gebruikte onderzoeken ontwikkelingsprocessen 5. RNA whole mount in situ hybridisatie kan voor de visualisatie en lokalisatie van specifieke gentranscripten in weefsels van het ontwikkelende embryo. Het expressiepatroon van de boodschap van een gen kan inzicht geven in wat ontwikkelingsprocessen en mobiele beslissingen over het lot van een gen kan besturen. Door vergelijking van het expressiepatroon van een gen in verschillende ontwikkelingsstadia, wordt inzicht verkregen in hoe de rol van een gen tijdens de ontwikkeling verandert.
Terwijl whole mount in situ is een middel te lokaliseren genexpressie weefsel histologische technieken voor het identificeren van gedifferentieerde celtypen en weefsels. Histologische kleuringen hebben uiteenlopende functies. Algemene vlekken worden gebruikt om celmorfologie te markeren, bijvoorbeeld hematoxyline en eosine kleuring algemeen kernen en het cytoplasma, respectievelijk. Andere vlekken kunnen markeren specifieke celtypes. Bijvoorbeeld, de alcianblauw vlek die in dit document is een veel gebruikte kationische vlek mucosaccharides identificeren. Kleuring van het spijsverteringskanaal met alcianblauw kunnen identificeren van de verdeling van slijmbekercellen die mucosaccharides produceren. Variaties in mucosaccharide bestanddelen op korte peptiden onderscheiden slijmbekercellen naar werking in het spijsverteringskanaal 6. Door het gebruik van RNA ganse berg in situ 's en histochemische methoden tegelijkertijd, kan cel beslissingen over het lot worden gekoppeld aan gen-specifieke expressie.
Hoewel RNA in situ 's en histochemie worden op grote schaal gebruikt door onderzoekers, hun aanpassing en gebruik op volle zee kraakbeenvissen ontmoet beperkt en gevarieerd succes. Hier presenteer ik protocollen ontwikkeld voor kraakbeenvissen en gebruikt op een regelmatige basis in mijn laboratorium. Hoewel verdere modificatie van het RNA in situ 's hybridisatiewerkwijze kan nodig aan verschillende soorten protocollen beschreven provide een sterk uitgangspunt voor onderzoekers willen het gebruik van mariene kraakbeenvissen aan te passen aan hun wetenschappelijke vragen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De gepresenteerde protocollen zijn klassieke methoden voor monitoring van genexpressie en identificeren gedifferentieerde celtypes, en zijn aangepast voor toepassing op schepen kraakbeenvissen. Verdere modificaties van deze protocollen kunnen nodig zijn om aan verschillende soorten kraakbeenvissen.
De meest voorkomende bezorgdheid over RNA whole mount in situ 's is het risico op besmetting RNase en daardoor de afbraak van de RNA probe en endogene berichten. Twee aspecten moeten …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ik wil de vele studenten die hebben gewerkt in mijn laboratorium en heeft bijgedragen aan de evolutie van deze protocollen bedanken. NAT heeft ontvangen steun van de Skidmore-EU-Netwerk, een project opgezet met een NSF betaalde voorschot subsidie.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase – SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ‘s. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. |
References
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T., Shuttleworth, R. . Physiology of elasmobranch fishes. , 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217, 1214-1222 (1982).
- Ballatori, N., Villalobos, A. Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models. Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).
- Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).
- Jass, J. R., Walsh, M. D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review. J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).
- Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae). J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).
- Echelard, Y., et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell. 75, 1417-1430 (1993).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, 7.82 (2001).
- Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
- Theodosiou, N. A., Simeone, A. Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea. Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).
- Filipe, M. I. Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review. Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).
- Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria. Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).
- Reid, B. J., et al. Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett’s esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort. Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).
- Mowry, R. Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status. Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).
- Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development. 125, 2791-2801 (1998).
