RNA<em> Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi> Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış
Summary
RNA tüm montaj yöntemleri birleştirerek<em> In situ</em> Hibridizasyon ve histoloji, gen ekspresyonu gelişen embriyonun hücre kaderi kararlar ile bağlantılı olabilir. Bu yöntemler deniz elasmobranchs uyarlanmış ve biyomedikal, toksikoloji ve karşılaştırmalı çalışmalar için model organizmalar olarak bu hayvanların kullanımını kolaylaştırmak edilmiştir.
Abstract
Adaptif bağışıklık var ve osmoregülasyon 1-3 için benzersiz mekanizmalara sahip en ilkel omurgalılar olarak Deniz elasmobranchs biyomedikal ve genomik çalışmalar için hayvan modellerinin değerlenir. Eşleştirilmiş ekleri ile en ilkel canlı çeneli-omurgalılar olarak elasmobranchs özellikle evrim ve gelişme çalışmaları için, evrimsel önemli bir model vardır. Deniz elasmobranchs ayrıca iklim değişikliğinin 4 ilişki sucul toksikoloji ve stres fizyolojisi incelemek için kullanılmıştır. Böylece, metodolojilerin geliştirilmesi ve adaptasyonu kolaylaştırmak ve çoklu biyolojik disiplinlerin bu ilkel omurgalıların kullanımını yaygınlaştırmak için gereklidir. İşte situ hibridizasyon ve gen ekspresyonu ve elasmobranchs hücre histolojisi çalışma histolojik teknikler RNA bütün mount başarılı uyum sunuyoruz.
Gen ekspresyonu İzleme gelişimsel başina bir işaretidir araçtırogists ve yaygın olarak gelişim süreçleri 5 incelemek için kullanılır. In situ hibridizasyon RNA bütün montaj gelişen embriyonun dokularda görselleştirme ve belirli bir gen transkript lokalizasyonu için izin verir. Bir genin mesajının ifade desen gelişimsel süreçler ve hücre kaderini belirleyen bir gen kontrol edebilir ne içgörü sağlayabilir. Farklı gelişim aşamalarında bir genin ekspresyonu desen karşılaştırarak, içgörü gelişimi sırasında gen değişikliklerinin nasıl rolüne elde edilebilir.
In situ 's tüm montaj dokuya gen ekspresyonu yerelleştirmek için bir araç sunarken, histolojik teknikler farklılaşmış hücre tipleri ve dokuların tespiti için izin verir. Histolojik lekeleri çeşitli işlevlere sahiptir. Genel lekeleri hücre morfolojisi vurgulamak için kullanılır, örneğin sırasıyla hematoksilen ve çekirdek ve sitoplazma genel boyama için eozin,. Vardır Diğer lekeleri spesifik hücre vurgulayabilirsiniztürleri. Örneğin, alcian mavi mucosaccharides belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir katyonik leke bu yazıda leke. Alcian mavisi ile sindirim sistemi Boyanması mucosaccharides üreten goblet hücrelerinin dağılımının tespit edebilirsiniz. Kısa peptidler üzerine mucosaccharide bileşenlerinin değişimleri sindirim sistemi 6 içinde işlevi tarafından goblet hücreleri ayırt. Eşzamanlı in situ 's ve histokimyasal yöntemlerle RNA bütün montaj kullanarak, hücre kaderini belirleyen gen-spesifik ekspresyonu ile bağlantılı olabilir.
RNA in situ 's ve histokimyası yaygın olarak araştırmacılar tarafından kullanılıyor olmasına rağmen, deniz elasmobranchs onların uyum ve kullanımı sınırlı ve çeşitli başarı tanıştım. İşte elasmobranchs için geliştirilen ve benim laboratuvarda düzenli olarak kullanılan protokoller mevcut. In situ 'in hibridizasyon metodu ile de RNA daha fazla değişiklik farklı türler uyum için gerekli olsa da, burada p açıklanan protokolonların bilimsel araştırmalar için deniz elasmobranchs kullanımı uyarlamak isteyen araştırmacılar için güçlü bir başlangıç noktası rovide.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan protokoller gen ekspresyonu izlenmesi ve farklılaşmış hücre türleri tespit için klasik yöntemlerdir ve deniz elasmobranchs kullanım için adapte edilmiştir. Bu protokollerin ayrıntılı değişiklikler farklı elasmobranch türlerin uyum için gerekli olabilir.
In situ 's RNA bütün montaj ile ilgili en yaygın endişe RNaz kontaminasyon riski ve böylece RNA probu ve endojen mesajları kayıplardır. İki yönleriyle dikkate alınması gerekir: Spastine Özg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Benim laboratuvarda çalışmış ve bu protokollerin evrimine katkıda bulunduğu birçok lisans öğrencilerine teşekkür etmek istiyorum. NAT Skidmore-Sendika Ağı, hibe ÖDENEN bir NSF ADVANCE ile kurulmuş bir proje destek aldı.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase – SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ‘s. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. |
References
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T., Shuttleworth, R. . Physiology of elasmobranch fishes. , 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217, 1214-1222 (1982).
- Ballatori, N., Villalobos, A. Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models. Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).
- Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).
- Jass, J. R., Walsh, M. D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review. J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).
- Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae). J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).
- Echelard, Y., et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell. 75, 1417-1430 (1993).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, 7.82 (2001).
- Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
- Theodosiou, N. A., Simeone, A. Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea. Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).
- Filipe, M. I. Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review. Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).
- Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria. Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).
- Reid, B. J., et al. Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett’s esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort. Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).
- Mowry, R. Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status. Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).
- Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development. 125, 2791-2801 (1998).
