RNA<em> 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서> 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응
Summary
RNA 전체 마운트하는 방법을 결합하여<em> 현장에서</em> 하이브리드 및 조직학은 유전자 발현은 개발 배아에서 세포 운명 결정과 연결 할 수 있습니다. 이 방법은 해양 elasmobranchs에 적응하고 생물 의학, 독성학 및 비교 연구를위한 모델 생물 이러한 동물의 사용을 촉진하고 있습니다.
Abstract
그들은 적응 면역을 가지고 osmoregulation 1-3에 대해 고유 한 메커니즘이 할 수있는 가장 원시적 인 vertebrates만큼 해양 elasmobranchs는 생물 의학 및 게놈 연구에 대한 동물 모델을 가치입니다. 페어링 된 부속과 함께 가장 원시적 인 생활 jawed – vertebrates으로 elasmobranchs 특히 진화 및 개발에 연구를 들어, evolutionarily 중요한 모델입니다. 해양 elasmobranchs는 기후 변화 4 관계에 수산물 독극물과 스트레스 생리학을 연구하는 데 사용되었습니다. 따라서, 방법론의 발전과 적응을 용이하게하고 여러 생물 분야에 이러한 원시적 인 vertebrates의 사용을 확대 할 필요합니다. 난 여기 원위치 하이브리드 화와 유전자 발현과 elasmobranchs의 세포 조직학을 연구하는 조직 학적 기술에 RNA 전체 마운트의 성공적인 적응을 제시한다.
유전자 발현을 모니터링하는 것은 발달 biol의 특징 도구입니다ogists, 널리 발달 과정, 5를 조사하는 데 사용됩니다. 현장 하이브리드 화의 RNA 전체 마운트는 개발 배아의 조직의 시각화 및 특정 유전자 성적의 국산화 할 수 있습니다. 유전자의 메시지의 표현 패턴은 개발 프로세스와 세포 운명 결정 유전자가 제어 할 수 있습니다 무엇에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 다른 발달 단계에서 유전자의 표현 패턴을 비교하여 통찰력은 개발 중에 유전자의 변화가 어떻게 역할을 습득 할 수 있습니다.
현장 's의 전체 마운트가 조직에 유전자 발현을 지역화 할 수있는 수단을 제공하지만, 조직 학적 기술은 차별화 된 세포 유형과 조직의 식별을 위해 수 있습니다. 조직 학적 얼룩은 다양한 기능을 가지고 있습니다. 일반 얼룩은 세포 형태를 강조하는 데 사용, 예를 들어 각각 hematoxylin 및 핵 및 세포질의 일반적인 착색을위한 eosin. 아르 다른 얼룩은 특정 셀을 강조 표시 할 수 있습니다유형입니다. 예를 들어, alcian 파란색은 mucosaccharides을 식별 할 널리 사용되는 양이온 얼룩은이 논문에서보고 청바지. alcian 푸른 색으로 소화 기관의 얼룩은 mucosaccharides을 생산 블렛 세포의 분포를 확인할 수 있습니다. 짧은 펩티드에 mucosaccharide 성분의 변화는 소화 기관 6 안에서 함수에 의해 블렛 셀을 구분합니다. 동시에 현장 's와 histochemical 방법으로 RNA 전체 마운트를 사용하여, 세포 운명의 결정은 유전자 특정 표현에 연결 할 수 있습니다.
RNA는 현장의와 histochemistry에 널리 연구자들에 의해 사용되고 있지만, 해양 elasmobranchs에서의 적응과 사용이 제한하고 다양한 성공을 충족시켜 왔습니다. 난 여기 elasmobranchs 개발과 연구소에서 정기적으로 사용하는 프로토콜을 제시한다. 현장의 하이브리드 방식의 RNA의 추가 수정이 종에 적응하기 위해 필요한 수 있지만, 프로토콜은 여기 P를 설명그들의 과학적인 문의에 해양 elasmobranchs의 사용을 적응하고자 연구자에 대한 강력한 출발점이 rovide.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시 프로토콜은 유전자 발현을 모니터링하고 차별화 된 세포 유형을 식별하기 위해 고전 방법이며, 해양 elasmobranchs에서 사용에 맞게 조정되었습니다. 이러한 프로토콜의 추가 수정이 다른 elasmobranch 종에 적응하기 위해 필요한 수 있습니다.
현장 's의 RNA 전체 마운트에 대한 가장 일반적인 문제는 RNase 오염의 위험함으로써 RNA 프로브 및 내생 메시지의 저하입니다. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
내 연구실에 근무하고 이러한 프로토콜의 발전에 공헌 한 많은 학부 학생을 감사하고 싶습니다. NAT는 Skidmore – 연합 네트워크 교부금을 지불 NSF 사전으로 설립 프로젝트에서 지원을 받았습니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase – SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ‘s. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. |
References
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