水素交換質量分析法を用いてタンパク質のダイナミクスを分析する
Summary
タンパク質の立体構造とダイナミクスは、タンパク質の構造と機能の関係を理解するための鍵となります。高分解能質量分析と組み合わせた水素の交換は、タンパク質のコンフォメーションのダイナミクスを研究だけでなく、接触インタフェースおよびアロステリック効果を含むタンパク質 – リガンドとタンパク質 – タンパク質相互作用を特徴付けるための汎用的な方法である。
Abstract
すべての細胞プロセスは、タンパク質の機能に依存します。所与のタンパク質の機能性は、そのユニークなアミノ酸配列の直接的な結果であるが、それは単一の定義された三次元配置またはより一般的には相互変換する立体配座のアンサンブル内にポリペプチド鎖の折り畳みによって実現される。タンパク質の立体構造とその機能との間の接続を調査すると、タンパク質は、タスクの彼らの多種多様を満たすことができる方法を完全に理解するために不可欠である。その機能的なサイクルを進行しながら、タンパク質が受けるコンホメーション変化を研究するための一つの可能性は、高分解能質量分析（HX-MS）と組み合わせた水素を1 H / 2 H交換である。 HX-MSは、 例えば結晶解析によって得られた構造情報に新たな次元を追加して汎用性の高い、堅牢な方法です。これは、小さいモルの結合は、フォールディング及びアンフォールディングタンパク質を研究するために使用されているeculeリガンド、タンパク質 – タンパク質相互作用、触媒作用、およびアロステリック酵素に連結コンホメーション変化。タンパク質の量は非常に限られているまたはタンパク質の結晶化が不可能な場合に加えて、HX-MSは、しばしば使用される。ここでは、HX-MSを用いたタンパク質のダイナミクスを研究するための一般的なプロトコルを提供し、どのように複雑では2つのタンパク質の相互作用界面を明らかにすることを例として説明します。
Introduction
タンパク質およびタンパク質複合体の結晶構造の数は、近年急速に増加した。彼らは、これらのタンパク質の構造組織の貴重なスナップショットを提示し、構造 – 機能分析のための基礎を提供する。しかし、タンパク質のダイナミクスとその機能のために不可欠な立体構造変化は、、めったにX線結晶構造解析によって明らかにされていません。クライオelectronmicroscopyは、一方で、異なる構造タンパク質およびタンパク質複合体を捕捉することができるが、一般的に二次構造レベル1にコンホメーション変化を下に解決できない。原子細部で溶液中のタンパク質のコンフォメーションダイナミックスは、NMRによって解決することができますが、この方法では、まだ比較的小さいサイズ（一般的には≤30 kDa）ののタンパク質に制限されて実験を妨げるタンパク質を高濃度（≥100μM）を、必要とされているオリゴマー化または凝集しやすいタンパク質2。一つの方法は、その高分解能X線結晶学およびクライオelectronmicroscopy間をブリッジすることができ、タンパク質サイズ又は濃度によって限定されないアミド水素1 H / 2質量分析（MS）と組み合わせたH-交換（HX）である。近年では、この方法は、タンパク質のダイナミクス、タンパク質のフォールディング、タンパク質の安定性およびコンフォメーション変化3-5の分析のための貴重な分析ツールを開発しました。この方法の分子的基礎は、タンパク質がD 2 O溶液中に置かれたときに重水素原子と交換するであろうタンパク質中の骨格アミド水素の不安定な性質である。経時的なタンパク質質量のその後の増加は、高分解能MSで測定する。
HXは温度のみに依存する短い非構造化ペプチド、触媒濃度–及び誘導のために隣接する残基のアミノ酸側鎖（OH、H 3 O +、すなわち pHが、 図3を参照）、ネコalyticと立体効果。固有の化学交換速度k CH ONこれらの効果は、エレガントな白ら 6によって定量化されたプログラムは、pHおよび温度に依存してポリペプチド内の各アミノ酸のK CHを算出する（礼儀Z.チャン）、提供されています。中性pH及び周囲温度でのk個のchが 10 1〜10 3秒-1のオーダーである。きつく折り畳まれたタンパク質の内部へのイオン–折り畳まれたタンパク質で、HXは、主に二次構造における水素結合とOHの水和のアクセス制限による軽微な程度に遅くなる大きさの2-9桁です。天然タンパク質中のHXはそのため部分的または全体的な展開、化学交換と式に従って天然の状態にリフォールディングを関与（1）とK OBS開口率kのOP、クロージング率kのCLと真性化学交換に依存して観測された為替レートRAテchの k個の式（2）に従って。
天然の状態条件下のk opは k個のchのよりもはるかに小さく、分母に無視することができる。 EX1とEX2と呼ばれる2の極端な為替制度があります。 k個のclが k chを （EX1）よりもはるかに小さい場合に観察された速度は、開口率と実質的に等しく、HXは、構造要素のアンフォールディングの直接の観察を可能にする。構造的要素の開始時に一度にすべてのアミドプロトン交換は、同位体ピーク7の二峰性の分布によって、MSに容易に観察可能であるような為替制度、。 k個のclが k chをよりはるかに大きい場合には、比例定数は折りたたみ展開均衡に等しいができる（EX2）が観察された速度は、k個のchのに比例する定数K uは k個のオペアンプ </sub> / K CL。同位体分布がほぼ同じままであるこれらの条件下では、多くの開閉イベントは、平均質量が徐々に増加をもたらす、重陽子のすべてのアミドプロトン交換前に必要である。 EX2体制はΔGUアンフォールディングの自由エネルギーと構造要素の、したがって安定性の決定を可能にする。ネイティブ状態の条件の下でEX2政権が最も一般的である。 pHとカオトロピック剤の添加の増加は、EX1に交換メカニズムをシフトすることができます。したがって、HX-MSは、熱力学ならびにタンパク質フォールディングの動力学的パラメーターおよびコンフォメーション変化を探索するために使用することができる。
HX上述したように本質的になる骨格アミド基の完全に露出したプロトン溶媒のpHおよび温度依存性の交換半減期は、生理的pH（pH7.6）中で5〜400ミリ秒、および30℃、しかし10分の間である> pHは2.9と0℃で> 2時間の平均は15時間（ およその半減期との交流ポリペプチドの最初の骨格アミド結合、1〜2分間のプロトンを除く）C。そのような遅い交換条件下ではタイムアウトが組み込ま重陽子に含まれるすべての情報を失うことに、これらの条件下で活性であるプロテアーゼ（ 例えばペプシン）を用いて試料を消化することができる。遅い交換の条件でペプシン消化の導入以来、完全長タンパク質の全体的なHX速度のみならず、解析することができますが、HXは特定の領域8,9に局在することができます。空間分解能は、現在、10〜30残基の間、一般的に消化され生成されたフラグメントの大きさに制限される。しかし、ペプシンによって起因する切断の非特異的な性質のために作成された重複フラグメントは、空間分解能の増加につながる可能性があります。さらに、いくつかの他のプロテアーゼしかしながら、はるかに効率的な10ペプシンより、急冷条件下で活性であることが判明した。さらにincrea空間分解能のそれは、例えば、電子捕獲解離（ECD）、電子移動解離（ETD）と、赤外多光子解離（IRMPD）11-13として重水素化パターンを保存方法によって、気相中のペプチドの断片化によって到達することができる。これらの技術は、衝突誘起解離（CID）によって観察された分子内プロトン移動（「スクランブル」）、最も一般的に使用される断片化法に空間分解能の損失を防ぐ。しかし、これらの方法は、すべての個々のペプチドについての最適化を必要とし、したがって、依然として非常に困難である。
HX-MSは、ウイルスキャプシドアセンブリ14-17を含むタンパク質-リガンドとタンパク質-タンパク質相互作用を分析するために使用されている。タンパク質がアンフォールディングおよびリフォールディングだけでなく、温度が誘発されるコンフォメーション変化は、7,18,19を調査した。リン酸化と、単一のアミノ酸変異に関連したコンホメーション変化16,20とnucleotアミド誘導変化は21,22を分析した。したがって、この方法は、アセンブリおよび分子機械の動力学を分析するために理想的に好適と思われる。そのメカニズム大将軍興味深い1つの魅力的な候補者は、Hsp90のシャペロン複合体である。
Protocol
Representative Results
Discussion
タンパク質に相互作用パートナーの結合は、必然的に結合部位に溶媒接近の変化を引き起こす。さらに、多くのタンパク質は、実際の結合界面以外の領域に影響を結合すると、動的な立体構造変化を受ける。 HX-MSは、これらの変更を監視するための堅牢な方法であり、他の方法もカバーすることはできませんタイムスケール上のタンパク質の立体構造変化を明らかにすることさえ可能です。 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿にコメントをM·ボイセンに感謝します。このプロジェクトは、（MPMに1278/4-1 SFB638とMA、そして卓越したクラスター：CellNetworks EXC 1分の81）ドイツ学術振興によって資金を供給された。 CellNetworks：MPMは卓越性のクラスタの研究者でもある。
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| maXis QTOF | Bruker | ||
| nanoAcquity UPLC | Waters Corp. | ||
| Shimadzu 10AD-VP | Shimadzu | ||
| 6-port Valve EPC6W with microelectric actuator | Valco | #EPC6W | |
| Injection valve (manual) | Rheodyne | #7725 | |
| Poros AL20 media | Applied Biosystems | #1-6029-06 | |
| Poros R2 | Applied Biosystems | #1-1118-02 | |
| Pepsin | Sigma | #P6887 | use fresh pepsin |
| Microbore (1 mm) | IDEX | #C-128 | |
| Microbore (2 mm) | IDEX | #C-130B | |
| Acquity UPLC BEH C8 Column | Waters Corp. | #186002876 | |
| Thermomixer | Eppendorf | #5355000.011 | |
| Tubing (various diameters) | IDEX | ||
| Fittings | IDEX | #PK-110 with PK-100 |
References
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