In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.
Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.
Letsel aan endotheliale bekleding van een bloedvat wordt hersteld door de hemostatische reactie of de vorming van een bloedstolsel. Wanneer bloed doordringt in de extracellulaire matrix, weefselfactoren activeert bloedplaatjes stroom die initiatie van de coagulatie cascade vergemakkelijken. De belangrijkste mechanische componenten van dit genezingsproces is de fibrine matrix, samengesteld uit fibrine vezels die zeer elastisch, en kan grote krachten 1-4 ondersteunen. Veel onderzoekers hebben de vorming van structuur en functie van fibrine uitgebreid bestudeerd in de afgelopen decennia 5-13.
Patiënten met ziekten zoals diabetes mellitus en sikkelcel hebben een verhoogd risico op trombotische complicaties zoals myocardinfarct, ischemische hartziekte, en lijnen 14-19. Meer dan 2 miljoen mensen zijn met nieuw gediagnosticeerde diabetes mellitus elk jaar in de Verenigde Staten. Er zijn twee types van diabetes: Type I, waarbij delichaam niet in slaagt om voldoende hoeveelheden insuline, en type II, waar het lichaam resistent wordt voor insuline te produceren. Bij patiënten met diabetes, cardiovasculaire ziekte (CVD) is de oorzaak van 80% van de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met de ziekte 20,21.
Sikkelcelziekte (SCZ) is een erfelijke bloedziekte die meer dan 100.000 mensen in de Verenigde Staten 22 beïnvloedt. SCD is een puntmutatie ziekte die rode bloedcellen veroorzaakt halvemaanvormige worden, waardoor het moeilijk voor de cellen door het bloed vasculatuur 23 te passen. Beide ziekten vergroten de kans op het ontwikkelen atherotrombotische omstandigheden in het lichaam. Eén van de redenen hiervoor is een gevolg van veranderde fibrine structuur en functie in zieke toestanden 14,24-26.
Zowel diabetes en sikkelcelziekte, is hypercoagulatie en hypofibrinolysis activiteit die atherotrombose en cardiovasculaire ziekte induceert (CVD) in vergelijking met gezonde patiënten 17,27,28. Het is bekend dat hypofibrinolysis bevordert progressie van atherosclerose en wekt terugkerende ischemische gebeurtenissen voor patiënten met premature kransslagaderziekte 29. In de huidige manuscript, onderzochten we de rol van fibrine fysische eigenschappen in deze specifieke setting. Fibrinestolsel structuren niet zieke patiënten bestaan uit dunne vezels, grotere poriën, en meestal minder dichte 14,24. De toegenomen porositeit en minder dichte fibrinestolsels bij gezonde patiënten zijn gevonden fibrinolyse 16 vergemakkelijken. In hyperthrombotic aandoeningen zoals diabetes en sikkelcelziekte, is er een toename van fibrinogeen productie, waardoor het fibrinogeen concentratie toenemen van normale niveaus van 2,5 mg / ml bij gezonde patiënten 30-33. Fibrine stolsels gevormd in diabetespatiënten gevonden minder poreus, stijver te zijn, meer vertakkingspunten en dichtere vergelijking met gezonde, niet-diabetic patiënten 14,24,33-35. De gewijzigde fibrine structuur is een gevolg van glycosylering mechanismen die optreden in de bij stolselvorming eiwitten. Niet-enzymatische (onomkeerbare) glycation treedt op wanneer glucose moleculen binden aan lysine residuen op de fibrinogeen molecuul, dat menselijke factor XIII bis (FXIIIa) niet goed verknoping glutamine en lysineresiduen 33,36,37 remt.
De structuuranalyse van fibrine netwerk is uitgebreid recent bestudeerd. In het bijzonder hebben onderzoekers elektronenmicroscopie en 3D reconstructie van fibrine netwerken 38, onderzocht hoe zowel intravasculaire (endotheel) cellen en extravasculaire (fibroblasten en gladde spier) cellen beïnvloeden fibrine structuur 39, gebruikt viscoelastische en spectraalanalyse in fibrine structuren 40 analyseren, en benut ontwikkelde correlaties tussen fibrine structuur en mechanische eigenschappen met behulp van experimentele en computationele benaderingen 41 </sup>. De focus van de huidige studie was om te stollen structuren te formuleren onder gesimuleerde diabetische en sikkelcelziekte trombose voorwaarden en confocale microscopie te gebruiken voor onderzoek naar de structuur en functie van de stolsels in zieke toestanden. Fibrinestolsels gevormd uit humaan fibrinogeen, humaan trombine en FXIIIa. De stolsels werden gelyseerd met plasmine. Om diabetesvoorwaarden simuleren, verhoogde concentratie van fibrinogeen werd geïncubeerd in glucoseoplossing in vitro fibrinogeen glycatie induceren. Aan sikkelcelanemie stolling omstandigheden te simuleren, werden verhoogd fibrinogeen concentraties gemengd met sikkelcelziekte hematocriet verzameld van patiënten zoals eerder gedaan door onze groep 42. Deze methoden werden gebruikt om de structuur en functies betrokken in fibrine stolselvorming en fibrinolyse onder ziektetoestanden, alsmede de mechanismen die CVD induceren onderzocht. Op basis van de huidige informatie over deze ziekten, de geglyceerde fibrinestolsel structuren waren dichter met minder eennd kleinere poriën. De fibrine stolsels met rode bloedcellen van sikkelcel patiënten (RBC) werden ook dichter en weergegeven aggregatie van de rode bloedcellen en fibrine geagglomereerde clusters. Dit is een gevestigde verschijnsel dat eerder 43 bepaald. Ook werd verondersteld dat de fibrinolyse percentage significant lager in geglyceerd fibrinestolsels met en zonder verminderde plasmine vergelijking met gezonde, normale fibrine is. De resultaten toonden dat voor geglycosileerd fibrinestolsels significant verschillend lysis coëfficiënt resulteert alleen in omstandigheden van verminderde concentratie plasmine waargenomen. Deze experimentele techniek van het gebruik van confocale microscopie biedt aanzienlijke voordelen boven andere beeldvormende technieken omdat de cellen en eiwitten blijven in hun natieve toestand, waarbij het vangen van real-time video van de stollingsactiviteit mogelijk maakt. Deze methode van synthetisch inducerende stolling is ook goedkoper en meer tijd efficiënter dan het verkrijgen van monsters van patiënten en te filteren op individueleeiwitten en enzymen. Bovendien, door gescheiden eiwitten en enzymen om stolsels synthetiseren, de stolsels werden gestandaardiseerd zodat er geen variabiliteit tussen monsters als gevolg van andere eiwitten in het plasma.
Om zinvolle gegevens over de structuur van stollingsmechanismen bij ziektetoestanden verkrijgen, is het belangrijk om de bij stolling om de effecten van de eiwitten en cellen onder deze omstandigheden vast factoren te isoleren. Dit protocol werd ontwikkeld ten behoeve van onderzoek naar de structuur van de fibrine klonter in diabetische cardiomyopathie toestanden in vitro.
Het is noodzakelijk om de bij de vorming van fibrine en fibrinolyse bij ziektetoestanden aangezien veranderde o…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
PBS | Life Technologies | 10010031 | |
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) | GE Healthcare | 45-001-749 | |
10 ml heparinized vacutainer tubes | BD Biosciences | 366643 | |
Human Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate | Molecular Probes | F13191 | |
0.5 mL graduated microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
Glucose powder | Life Technologies | 15023-02 | |
FXIIIa | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
VIS Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 | LSM 510 | |
50 mM Tris | Lonza | S50-642 | |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
Vybrant DiD cell-labeling solution | Life Technologies | L7781 | |
Plasmin | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
Sodium Chloride (5 M NaCl) | Life Technologies | AM9759 | |
Statistical Modeling Software | IBM | SPSS Statistics 22 |