정상과 병에 걸린 미국에서 혈병 구조를 조사하기위한 실험 및 이미징 기술
Summary
In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.
Abstract
Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.
Introduction
혈관의 내피 라이닝 부상은 지혈 반응, 또는 혈전 형성을 통해 복구된다. 혈액 세포 외 매트릭스에 침투 할 때, 조직 인자는 응고 캐스케이드의 개시를 촉진 혈류 혈소판 활성화. 이 치유 과정의 핵심 요소는 기계적 고탄성 아르 피브린 섬유로 구성된 피브린 매트릭스이며, 큰 힘을 견딜 수있는 1-4. 많은 연구자들은 광범위 지난 수십 5-13 피브린의 형성 구조 및 기능을 연구 하였다.
예컨대 당뇨병 및 겸상 적혈구 질환 등 환자는 심근 경색, 허혈성 심질환 등의 혈전 성 합병증의 발병 위험이 증가하고, 14 ~ 19 스트로크. 2 백만 명 이상의 사람들이 새로 미국에서 매년 당뇨병으로 진단된다. 유형 I 여기서, : 두 가지 형태가있다몸은 몸이 인슐린에 저항하게 인슐린 및 유형 II, 충분한 양을 생산하는 데 실패합니다. 당뇨병 환자 중, 심혈관 질환 (CVD)는 질병 (20, 21)과 관련된 이환율과 사망율 80 %의 원인이다.
겸상 적혈구 질환 (SCD)는 미국 22 개 이상 십만명에 영향을 미치는 유전 적 혈액 질환이다. SCD 어려운 세포가 혈액 맥관 구조 (23)를 통과하도록하기 위해, 초승달 모양 될 적혈구 발생 점 돌연변이 질환이다. 이들 질환 상태는 모두 몸에서 죽상 조건을 개발할 가능성을 증가시킨다. 이에 대한 이유 중 하나는 병에 걸린 상태에서 변경 14,24-26 피브린의 구조와 기능의 결과이다.
모두 당뇨병과 겸상 적혈구 질환에서 hypercoagulation 및 죽상 혈전증과 심혈관 질환을 유발 hypofibrinolysis 활동 (C가있다VD) 건강한 환자에 비해 17,27,28. 이 hypofibrinolysis이 죽상 동맥 경화증의 진행을 촉진하고 조기 관상 동맥 질환 29 환자 재발 허혈성 이벤트를 낳는다 것으로 알려져있다. 현재 원고에서, 우리는이 특정 설정에 섬유소 물리적 특성의 역할을 조사했다. 비 병든 환자 혈병 구조는 얇은 섬유, 큰 모공, 일반적으로 밀도가 낮은 (14, 24)로 구성된다. 건강한 환자에서 증가 된 다공성 및 저밀도 피브린 혈병 16은 섬유소 용해를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 당뇨 및 겸상 적혈구 질환 hyperthrombotic 조건에서, 건강한 환자들 30-33에서 2.5 ㎎ / ㎖의 정상 수준에서 증가하는 피브리노겐 농도를 일으키는 피브리노겐 생산의 증가가있다. 건강한 비 DIA에 비해 당뇨병 환자에 형성된 피브린 혈병 더 분기점을 가지고, 밀도, 더 강성, 다공성이 덜한 것으로 밝혀졌다betic 환자 14,24,33-35. 변형 구조는 피브린 응괴 형성에 관여하는 단백질 당화 발생 메커니즘의 결과이다. 포도당 분자가 적절하게 가교 글루타민 리신 잔기 33,36,37에서 인간 인자 XIIIa에 (FXIIIa)를 억제 피브리노겐 분자에 리신 잔기에 결합 할 때 비 효소 (비가역) 당화 발생한다.
피브린 네트워크의 구조 분석은 최근 광범위하게 연구되어왔다. 특히, 연구자들은 전자 현미경과 혈관 (내피) 세포와 혈관 외 (섬유 아 세포 및 평활근) 모두 세포는 섬유소 구조 (40)를 분석하는 섬유소 구조 (39), 이용 점탄성과 스펙트럼 분석에 미치는 영향을 조사 섬유소 네트워크 (38)의 차원 복원 등을 활용 한 피브린 구조 및 기계적 특성 간의 상관 관계를 실험 개발하여 전산 41 접근 </sup>. 본 연구의 초점은 시뮬레이션 당뇨병과 겸상 적혈구 혈전증 조건 하에서 응고 구조를 수립하고 병에 걸린 상태에서 혈전의 구조 검사 및 기능에 대한 공 초점 현미경을 사용하는 것이 었습니다. 섬유소 혈전 인간 피브리노겐, 트롬빈 및 FXIIIa에서 형성되었다. 혈전은 플라스 민을 사용하여 용해시켰다. 당뇨병 조건을 시뮬레이션하기 위해, 피브리노겐의 농도 증가는 체외 피브리노겐 당화를 유도하기 위해 포도당 용액에서 배양 하였다. 겸상 적혈구 질환 응고 조건을 시뮬레이션하기 위해 증가 피브리노겐 농도는 우리 그룹 (42)에 의해 이전에 수행으로 환자로부터 수집 겸상 적혈구 용적률과 혼합 하였다. 이러한 방법은 질병 및 구조 조건 하에서 피브린 응괴 형성 및 섬유소 용해에 관여하는 기능뿐만 아니라, CVD 유도 메커니즘을 조사 하였다. 이들 질환에 대한 현재 정보에 기초하여, 당화 피브린 응고 구조는 적은 밀도로했다ND 작은 구멍. 겸상 적혈구 환자 (적혈구)에서 적혈구와 섬유소 혈전은 밀도가 있었고, 적혈구의 응집과 응집 섬유소 클러스터를 표시. 이것은 이전에 43 결정된 노포 현상이다. 또한 섬유소 레이트와 건강한 정상 피브린에 비해 감소 플라스없이 당화 피브린 혈병에 훨씬 낮은 것이라고 가정 하였다. 결과는 당화 피브린 혈병 대해 상당히 상이한 용해 속도 결과 만 감소 플라스 농도 조건 하에서 관찰 된 것으로 나타났다. 세포 및 단백질이 응고 활성의 실시간 비디오의 캡처를 가능하게 그 나라의 상태로 남아 있기 때문에, 공 초점 현미경을 사용하여이 실험은 다른 이미징 기술의 방법들에 비해 현저한 장점들을 제공한다. 합성 유도부 응고이 방법은 환자의 샘플을 획득하고 개인을 필터링 또한보다 저렴하고 더 시간 효율적인단백질과 효소. 샘플 간의 변이성은 다른 혈장 단백질의 결과로서 없었다되도록 또한 혈전을 합성 분리 된 단백질 및 효소를 사용하여, 혈전 표준화 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
질환 상태에서 응고 메카니즘의 구조에 대한 의미있는 데이터를 얻기 위해서는, 이러한 조건에서 단백질 및 세포의 효과를 결정하기 위해 혈액 응고에 관여하는 인자를 분리하는 것이 중요하다. 이 프로토콜 및 시험 관내에서 당뇨병 상태에서 SCD 피브린 응괴의 구조를 조사하는 목적으로 개발되었다.
이는 변경된 조건 hypercoagulation, 죽상 혈전증 및 CVD 발생할 보낸 질?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS | Life Technologies | 10010031 | |
| Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) | GE Healthcare | 45-001-749 | |
| 10 ml heparinized vacutainer tubes | BD Biosciences | 366643 | |
| Human Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate | Molecular Probes | F13191 | |
| 0.5 mL graduated microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Glucose powder | Life Technologies | 15023-02 | |
| FXIIIa | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| VIS Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 | LSM 510 | |
| 50 mM Tris | Lonza | S50-642 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| Vybrant DiD cell-labeling solution | Life Technologies | L7781 | |
| Plasmin | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Sodium Chloride (5 M NaCl) | Life Technologies | AM9759 | |
| Statistical Modeling Software | IBM | SPSS Statistics 22 |
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