正常および疾患米国でフィブリンクロット構造を調べるための実験とイメージング技術
Summary
In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.
Abstract
Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.
Introduction
血管の内皮内層に損傷は止血応答、または血栓の形成を通じて修復される。血液は、細胞外マトリックスに浸透すると、組織因子は、凝固カスケードの開始を容易に血流中の血小板を活性化する。この治癒過程の重要な機械的な構成要素は、高弾性であるフィブリン繊維からなるフィブリンマトリックスであり、かつ大きな力1-4を維持することができる。多くの研究が盛んに過去数十5-13フィブリンの形成構造、および機能を研究している。
例えば、糖尿病および鎌状赤血球のような疾患を有する患者は、心筋梗塞、虚血性心疾患、および脳卒中14-19として血栓性合併症を発症するリスクを有する。 200万人以上の人が新たに米国で毎年糖尿病と診断されている。タイプI：糖尿病には2つの種類があります本体は、体がインスリン抵抗性となり、インスリン、およびタイプII、十分な量を生産することができない。糖尿病患者では、心血管疾患（CVD）は、疾患20,21に関連する罹患率および死亡率の80％の原因である。
鎌状赤血球症（SCD）は、米国22で10万人以上の人々に影響を与える遺伝的血液疾患です。 SCDは難しい細胞が血管系23を通過できるようにすること、三日月形になるように、赤血球を引き起こす点突然変異疾患である。これらの疾患状態の両方は、体内のアテローム血栓性の状態を発症する可能性を高める。この理由の一つは、疾患状態14,24-26における変化したフィブリン構造と機能の結果である。
糖尿病や鎌状赤血球症の両方において、アテローム血栓症および心血管疾患（Cを誘導し、凝固亢進とhypofibrinolysis活動がありますVD）健康な患者17,27,28と比較した。これはhypofibrinolysisは、アテローム性動脈硬化症の進行を促進し、早期冠動脈疾患を有する患者について29再発虚血イベントを拘禁することが知られている。現在の原稿では、この特定の設定で、フィブリンの物理的特性の役割を調べた。非疾患患者におけるフィブリン血餅の構造は、薄い繊維、より大きな孔、及び一般に低密度の14,24で構成されている。健康な患者における気孔率の増加及び低密度のフィブリン塊は、線溶16を容易にすることが見出されている。糖尿病及び鎌状赤血球症などhyperthrombotic条件で、健康な患者30-33に2.5 mg / mlの正常レベルから増加するフィブリノーゲン濃度を引き起こすフィブリノゲン産生の増加がある。健康な、非直径と比較して、糖尿病患者に形成されたフィブリン塊は、以上の分岐点を有する、より高密度、より剛性の、多孔性の低いことが見出されているbetic患者14,24,33-35。改変されたフィブリン構造が血栓形成に関与するタンパク質中に存在する糖化メカニズムの結果である。グルコース分子が適切に架橋グルタミンおよびリジン残基33,36,37からのヒト第XIIIa因子（活性化XIII因子）を阻害フィブリノゲン分子、上のリジン残基に結合したときに非酵素（不可逆）糖化が起こる。
フィブリンネットワークの構造解析は、最近広く研究されている。特に、研究者は、電子顕微鏡および血管（内皮）細胞および血管外（線維芽細胞および平滑筋）双方の細胞がフィブリン構造40を分析するフィブリン構造39を利用粘弾性スペクトル解析にどのように影響するかを調べたフィブリンネットワーク38の3D再構成などを利用している実験を使用してフィブリン構造と機械的特性との間の相関を開発し、計算は、41に近づく </sup>。現在の研究の焦点は、シミュレートされた糖尿病及び鎌状赤血球症条件下血餅構造を定式化し、疾患状態における血塊の構造および機能の検査のために、共焦点顕微鏡を使用することであった。フィブリン塊は、ヒトフィブリノーゲン、ヒトトロンビン、および活性化XIII因子から形成された。血栓は、プラスミンを用いて溶解した。糖尿病状態をシミュレートするために、フィブリノゲン濃度の増加は、 インビトロでのフィブリノーゲン糖化を誘発するためにグルコース溶液中でインキュベートした。鎌状赤血球症凝固条件をシミュレートするために、増加したフィブリノゲン濃度は、我々のグループ42によって、以前に行われたように患者から採取した鎌状赤血球ヘマトクリットと混合した。これらの方法は、構造および機能病的条件下でのフィブリン塊の形成及びフィブリン溶解に関与するだけでなく、CVDを誘導するメカニズムを調べた。これらの疾患についての現在の情報に基づいて、糖化されたフィブリン塊構造は、少数のAでより高密度であったND小さな孔。鎌状赤血球患者からの赤血球（RBC）とフィブリン塊はまた、より高密度でありRBCおよび凝集フィブリンクラスターの凝集を示した。これは、以前に43決定された十分に確立された現象である。また、線維素溶解率が健全な、正常なフィブリンと比較して減少しプラスミンとない糖化フィブリン塊に有意に低いであろうと仮説を立てた。結果は、糖化フィブリン塊のために、著しく異なる溶解速度の結果だけ減少プラスミン濃度の条件下で観察されたことを示した。細胞およびタンパク質が凝固活性のリアルタイムビデオのキャプチャを可能にするそれらの天然の状態で残っているため、共焦点顕微鏡を使用して、この実験的手法は、他の撮像方法を超える有意な利点を提供する。合成的に誘導凝固のこの方法は、患者のサンプルを取得し、個々のフィルタリングより効率的で安価でより多くの時間であるタンパク質および酵素。サンプル間のばらつきは、プラズマ中の他のタンパク質の結果として存在しなかったように、また、血栓を合成するために分離されたタンパク質および酵素を使用することにより、血栓を標準化した。
Protocol
Representative Results
Discussion
疾患状態における凝固機構の構造についての意味のあるデータを得るためには、これらの条件下でのタンパク質および細胞の効果を決定するために、凝固に関与する因子を単離することが重要である。このプロトコルは、in vitroで 、糖尿病およびSCDの状態でフィブリン塊の構造を調査する目的で開発された。
改変された条件は、凝固亢進、アテローム血栓症、お?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS | Life Technologies | 10010031 | |
| Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) | GE Healthcare | 45-001-749 | |
| 10 ml heparinized vacutainer tubes | BD Biosciences | 366643 | |
| Human Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate | Molecular Probes | F13191 | |
| 0.5 mL graduated microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Glucose powder | Life Technologies | 15023-02 | |
| FXIIIa | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| VIS Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 | LSM 510 | |
| 50 mM Tris | Lonza | S50-642 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| Vybrant DiD cell-labeling solution | Life Technologies | L7781 | |
| Plasmin | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Sodium Chloride (5 M NaCl) | Life Technologies | AM9759 | |
| Statistical Modeling Software | IBM | SPSS Statistics 22 |
References
- Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
- Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
- Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
- Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
- Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
- Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
- Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
- Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
- Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
- Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
- Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
- Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
- Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
- Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
- Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
- Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
- Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
- Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
- Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
- Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
- Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
- Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
- Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
- Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
- Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
- Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
- Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
- Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
- Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
- Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
- Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
- Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
- Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
- Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
- Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781 (2012).
- Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212 (1957).
- Kuehl, R. O. . Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , (2000).
- Lindman, H. R. . Analysis of variance in experimental designs. , (1992).
- Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
- Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
- Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, 45 (1998).
