טכניקות ניסיוניות והדמיה לבחינת מבני פיברין קריש בבריאה והחולה הברית
Summary
In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.
Abstract
Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.
Introduction
פגיעה ברירית האנדותל של כלי דם לתיקון דרך התגובה לעצרת הדם, או היווצרות של קריש דם. כאשר דם מחלחל לתוך מטריצת החוץ תאית, גורמי רקמה להפעיל טסיות דם בזרם הדם המאפשרים חניכה של מפל הקרישה. המרכיב המכני המפתח של תהליך ריפוי זה הוא מטריצת הפיברין, מורכבת מסיבי הפיברין שאלסטיות גבוהה, ויכול לקיים כוחות גדולים 1-4. חוקרים רבים חקרו את מבנה המערך, ותפקוד של הפיברין בהרחבה בעשורים האחרונים 5-13.
יש חולים במחלות כגון סוכרת וחרמשית סיכון מוגבר לפתח סיבוכים טרומבוטיים כגון אוטם שריר לב, מחלת לב איסכמית, ומלטף 14-19. מעל 2 מיליון אנשים שאובחנו לאחרונה עם סוכרת בכל שנה בארצות הברית. ישנם שני סוגים של סוכרת: הסוג I, שבוגוף לא מצליח לייצר כמות מספקת של אינסולין, וסוג השני, שבו הגוף הופך עמיד לאינסולין. בקרב חולי סוכרת, מחלות לב וכלי דם (CVD) היא הסיבה ל- 80% מהתחלואה והתמותה הקשורים במחלה 20,21.
מחלה מגל תא (SCD) היא הפרעה גנטית המשפיעה על דם יותר מ -100,000 אנשים בארצות הברית 22. SCD הוא מחלה נקודה-מוטציה שגורמת לתאי דם אדומים להפוך בצורה חצי סהר, מה שהקשה על התאים לעבור בכלי דם הדם 23. שתי מדינות מחלה אלה מגבירים את הסיכוי לפתח תנאי atherothrombotic בגוף. אחת הסיבות לכך היא תוצאה של מבנה הפיברין שינה ותפקוד במצבים חולים 14,24-26.
בשתי הסוכרת ומחלות חרמשית, יש hypercoagulation ופעילות hypofibrinolysis שגורמת atherothrombosis ומחלות לב וכלי דם (CVD), בהשוואה למטופלים בריאים 17,27,28. זה ידוע שhypofibrinolysis מקדם התקדמות טרשת עורקים ומולידה אירועים איסכמיים חוזרים בחולים עם מחלת לב כלילית מוקדמת 29. בכתב היד הנוכחית, החוקרים בחנו את התפקיד של תכונות פיזיות הפיברין בהגדרה המסוימת הזה. מבני קריש הפיברין בחולים שאינם חולים מורכבים מסיבים דקים, נקבוביות גדול, ו14,24 בדרך כלל פחות צפופים. הנקבוביות המוגברת וקרישי פיברין פחות צפופים בנבדקים בריאים נמצאו כדי להקל על פירוק פיברין 16. בתנאי hyperthrombotic כגון מחלת סוכרת תא ומגל, יש עלייה בייצור פיברינוגן, גורמת לריכוז פיברינוגן להגדיל מהרמות נורמליות של 2.5 מ"ג / מיליליטר בחולים בריאים 30-33. קרישי פיברין נוצרו בחולי סוכרת נמצאו להיות פחות נקבובי, נוקשה יותר, יש יותר נקודות סניף, וצפוף יותר בהשוואה למי שאינו dia הבריא,חולי betic 14,24,33-35. מבנה הפיברין שינה הוא תוצאה של מנגנוני glycation המתרחשים בחלבונים מעורבים בהיווצרות קריש דם. glycation Nonenzymatic (בלתי הפיך) מתרחש כאשר מולקולות גלוקוז להיקשר לשאריות ליזין על מולקולת פיברינוגן, אשר מעכבת XIIIa האנושי גורם (FXIIIa) משאריות גלוטמין וליזין cross-linking כראוי 33,36,37.
הניתוח המבני של רשתות הפיברין נחקר בהרחבה לאחרונה. בפרט, חוקרים נצלו את מיקרוסקופ אלקטרונים ושחזור 3D של רשתות הפיברין 38, חקרו כיצד תאים שני תאי intravascular (אנדותל) וextravascular (fibroblasts ושריר חלק) משפיעים על מבנה הפיברין 39, viscoelastic מנוצלת וניתוח ספקטרלי לנתח מבני הפיברין 40, ו מתאמים מפותחים בין מבנה ליפין ותכונות מכאניות באמצעות ניסוי וחישובי גישות 41 </sup>. המוקד של המחקר הנוכחי היה לגבש מבני קריש בתנאים פקקת תא סוכרת ומגל מדומים ולהשתמש במיקרוסקופ confocal לבחינת המבנה ותפקוד של קרישים במדינות נגועות. קרישי פיברין נוצרו מפיברינוגן האנושי, תרומבין האנושי, וFXIIIa. קרישים היו lysed באמצעות פלסמין. כדי לדמות תנאים סוכרתיים, ריכוז מוגבר של פיברינוגן הודגרה בפתרון גלוקוז כדי לגרום במבחנת glycation פיברינוגן. כדי לדמות תנאי קרישת מחלה חרמשית, ריכוזי פיברינוגן מוגברים היו מעורבים עם המטוקריט חרמשית שנאסף מחולים כפי שנעשה בעבר על ידי הקבוצה שלנו 42. שיטות אלה שמשו לבדיקת המבנה והפונקציות מעורבות בהיווצרות קריש הפיברין ופירוק פיברין בתנאים חולים, כמו גם את המנגנונים שגורמים לCVD. בהתבסס על מידע נוכחי על מחלות אלו, מבני קריש הפיברין Glycated היו צפופים יותר עם פחותnd נקבוביות קטן יותר. קרישי פיברין עם תאי דם אדומים של חולי אנמיה חרמשית (RBCs) היו גם צפופים ומוצגים אגרגציה של תאי הדם האדומים ואשכולות הפיברין מגובבים. זוהי תופעה מבוססת היטב כי כבר נקבעה בעבר 43. כמו כן, החוקרים שיערו כי שיעור הפירוק פיברין יהיה נמוך באופן משמעותי בקרישי פיברין Glycated עם ובלי פלסמין המופחת בהשוואה ליפין בריא, נורמלי. התוצאות הראו כי לקרישי פיברין Glycated, תוצאות שיעור תמוגה שונות באופן משמעותי נצפו רק בתנאים של ריכוז פלסמין מופחת. טכניקה ניסויית זו של שימוש במיקרוסקופ confocal מציעה יתרונות משמעותיים על פני שיטות הדמיה אחרות, כי התאים והחלבונים להישאר במדינה האם שלהם, המאפשרת הלכידה וידאו של פעילות הקרישה בזמן אמת. שיטה זו של קרישה סינטטי התרמה היא גם זולה יותר ויעילה יותר זמן מאשר קבלת דגימות מטופל וסינון בודדחלבונים ואנזימים. יתר על כן, על ידי שימוש בחלבונים ואנזימים מופרדים לסנתז קרישים, קרישים היו סטנדרטיים, כך שלא היה שונות בין דגימות כתוצאה מחלבונים אחרים בפלזמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לקבל נתונים משמעותיים על המבנה של מנגנוני קרישה במצבי מחלה, חשוב לבודד את הגורמים מעורבים בקרישה כדי לקבוע את ההשפעות של החלבונים ותאים בתנאים אלה. פרוטוקול זה פותח לצורך חקירת המבנה של קריש הפיברין במדינות סוכרת וSCD במבחנה.
<p class="jove_content" style=";text-align:right;directio…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS | Life Technologies | 10010031 | |
| Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) | GE Healthcare | 45-001-749 | |
| 10 ml heparinized vacutainer tubes | BD Biosciences | 366643 | |
| Human Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate | Molecular Probes | F13191 | |
| 0.5 mL graduated microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Glucose powder | Life Technologies | 15023-02 | |
| FXIIIa | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| VIS Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 | LSM 510 | |
| 50 mM Tris | Lonza | S50-642 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| Vybrant DiD cell-labeling solution | Life Technologies | L7781 | |
| Plasmin | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Sodium Chloride (5 M NaCl) | Life Technologies | AM9759 | |
| Statistical Modeling Software | IBM | SPSS Statistics 22 |
References
- Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
- Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
- Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
- Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
- Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
- Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
- Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
- Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
- Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
- Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
- Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
- Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
- Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
- Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
- Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
- Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
- Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
- Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
- Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
- Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
- Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
- Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
- Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
- Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
- Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
- Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
- Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
- Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
- Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
- Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
- Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
- Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
- Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
- Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
- Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781 (2012).
- Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212 (1957).
- Kuehl, R. O. . Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , (2000).
- Lindman, H. R. . Analysis of variance in experimental designs. , (1992).
- Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
- Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
- Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, 45 (1998).
