Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.
Abstract
Het bepalen van het werkingsmechanisme van bioactieve stoffen is van belang om een breed scala van academische, farmaceutische en industriële wetenschappers. Saccharomyces cerevisiae, of gist is een modeleukaryoot waarvoor een complete collectie van ~ 6000 gendeletie mutanten en hypomorfe essentieel gen mutanten zijn commercieel verkrijgbaar. Deze verzamelingen van mutanten kan gebruikt worden om systematisch detecteren chemische geninteracties, dwz genen noodzakelijk een chemische tolereren. Deze gegevens zijn beurt verslagen over de waarschijnlijke werkingsmechanisme van de verbinding. Hier beschrijven we een protocol voor de snelle identificatie van chemische-genetische interacties in gist. We demonstreren de werkwijze met het chemotherapeutische middel 5-fluorouracil (5-FU), die een goed gedefinieerde werkingsmechanisme heeft. Onze resultaten tonen dat de nucleaire TRAMP exosome RNA en DNA repair enzymen zijn nodig voor proliferatie in de aanwezigheid van 5-FU, hetgeen in overeenstemming met eerdere microarray gebaseerd barcoderingssysteem chemische genetische benaderingen en de wetenschap dat 5-FU negatieve invloed op zowel RNA en DNA-metabolisme. De vereiste valideringsprotocols deze high-throughput schermen worden ook beschreven.
Introduction
De genetische instrumenten en middelen die beschikbaar zijn in het model organisme Saccharomyces cerevisiae hebben grootschalige functionele genomica studies die gezamenlijk zorgen voor nieuw inzicht in hoe genen functioneren als netwerken om aan de eisen van biologische systemen voldoen ingeschakeld. De hoeksteen van deze tools was het collectief creëren van een complete set van niet-essentiële gendeleties van alle open reading frames in gist 1,2. Een opvallende observatie was dat slechts ~ 20% gist genen vereist voor levensvatbaarheid wanneer gegroeid haploïden onder standaard laboratoriumomstandigheden. Dit wijst op het vermogen van een cel buffer tegen genomische verstoringen door het gebruik van alternatieve biologische routes. Genetische mutanten die levensvatbaar zijn individueel, maar dodelijk in combinatie, signaleren aangesloten of convergente parallel biologische pathways en vormen genetische interactie netwerken die biologische functie te beschrijven. Met de ontwikkeling van conditionele temperature-gevoelige en hypomorphic allelen van essentiële genen technologie is niet beperkt tot de studie van niet-essentiële genen 3,4. Dit concept is toegepast op genomisch schaal produceren van een zuivere genetische interactie kaart illustreert hoe genen betrokken bij soortgelijke cellulaire processen cluster samen 5.
Chemische verstoringen van genetische netwerken nabootsen gen deleties (figuur 1) 6. Opvragen groeiremmende verbindingen tegen een array met hoge dichtheid van deletie stammen voor overgevoeligheid wordt een chemisch-genetische interactie profiel, bijvoorbeeld een lijst van genen die nodig is om chemische belasting verdragen. Zoals genetische interacties grote schermen van chemische bibliotheken hebben aangetoond dat verbindingen met een soortgelijk werkingsmechanisme cluster samen 7. Daarom is door de oprichting van de chemische-genetische interactie profiel van een verbinding het werkingsmechanisme kan worden afgeleid door het te vergelijken met de LARge-schaal synthetische genetische en chemische genetische interactie datasets 8,9.
Zijn op grote schaal chemische-genetische screens, waar scores van verbindingen worden ondervraagd, uitgevoerd door barcode competitie assays. In deze benadering wordt de gepoolde verzameling van deletie stammen gekweekt massaal meerdere generaties in een kleine hoeveelheid medium met een chemische stof. Aangezien elke deletie mutant herbergt een unieke genetische barcode, wordt de levensvatbaarheid / groei van individuele mutanten binnen de pool van deletiestammen bijgehouden door microarray of high-throughput sequencing 10.
Afleiden van fitness door het monitoren kolonie grootte van fysiek gekleed mutanten gegroeid op vaste agar dat een bioactieve verbinding is ook een effectieve methode om de chemische-genetische interacties 11,12 identificeren. Deze benadering verschaft een kosteneffectief alternatief voor concurrentie gebaseerde screening en is zeer geschikt voor het testen van kleine bibliotheken van chemische stoffen.Hier geschetst is een eenvoudige methode voor het produceren van een lijst van chemisch-genetische interacties in S. cerevisiae die niet afhankelijk moleculaire biologie manipulaties of infrastructuur. Het vereist slechts een gist deletie verzameling, een robot of handmatig pinning apparaten en vrij beschikbare beeldanalyse software.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier geschetst is een aanpak voor het genereren van chemisch-genetische interactie profielen. De werkwijze is eenvoudig: bij het vergelijken kolonie groottes van elke stam in uitgebreide gendeletie collecties in de aanwezigheid en afwezigheid van een chemische stof, worden alle genen nodig om een chemische insult tolereren geïdentificeerd. Annotatie verrijking analyse van de resulterende lijst van gevoelige stammen kunnen vervolgens worden gebruikt om inzicht in een chemische werkingswijze. Hoewel dit protocol is…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek in de CJN lab wordt ondersteund door exploitatiesubsidies uit NSERC, de Canadian Cancer Society Research Institute (CCSRI), en de Canadese Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) – Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12 well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
References
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
- Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
- Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
- Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
- Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
- Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
- Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
- Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
- Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
- Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
- Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
- Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
- Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
- Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).
