Identification rapide des interactions chimiques génétiques dans<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.
Abstract
Déterminer le mode d'action des produits chimiques bioactifs est d'intérêt pour un large éventail d'universitaires, pharmaceutiques, et les scientifiques industriels. Saccharomyces cerevisiae, ou levure bourgeonnante, est un eucaryote modèle pour lequel une collection complète de ~ 6000 mutants de délétion du gène et gène essentiel hypomorphic mutants sont disponibles dans le commerce. Ces collections de mutants peuvent être utilisés pour détecter systématiquement des interactions chimiques de gènes, à savoir les gènes nécessaires pour tolérer un produit chimique. Cette information, à son tour, des rapports sur le mode d'action probable du composé. Ici, nous décrivons un protocole pour l'identification rapide des interactions chimiques-génétiques dans la levure bourgeonnante. Nous démontrons le procédé utilisant l'agent chimiothérapeutique 5-fluorouracile (5-FU), qui possède un mécanisme bien défini de l'action. Nos résultats montrent que l'ARN nucléaire TRAMP exosomes réparation de l'ADN et les enzymes sont nécessaires pour la prolifération en présence de 5-FU, qui est compatible avec m précédenteicroarray approches génétiques basés codes barres chimiques et la connaissance que le 5-FU néfaste à la fois l'ARN et l'ADN métabolisme. Les protocoles de validation requis de ces écrans à haut débit sont également décrits.
Introduction
Les outils et les ressources disponibles dans l'organisme modèle Saccharomyces cerevisiae génétiques ont permis à grande échelle de génomique fonctionnelle études qui fournissent collectivement un nouvel éclairage sur la façon dont les gènes fonctionnent comme des réseaux pour répondre aux exigences des systèmes biologiques. La pierre angulaire de ces outils a été la création en collaboration d'un ensemble complet de délétions de gènes non-essentiels de tous les cadres de lecture ouverts dans la levure 1,2. Une observation frappante était que seulement environ 20% des gènes de levure sont nécessaires pour la viabilité lorsqu'il est cultivé comme haploïdes dans des conditions de laboratoire standard. Cela met en évidence la capacité d'une cellule à tampon contre les perturbations génomiques grâce à l'utilisation des voies biologiques alternatives. Mutants génétiques qui sont viables individuellement, mais en combinaison mortelle, signalent les voies biologiques parallèles ou convergentes connectés et forment des réseaux d'interactions génétiques qui décrivent la fonction biologique. Avec le développement de te conditionnelleallèles mpérature-sensibles et hypomorphic de gènes essentiels de la technologie n'a pas été limité à l'étude des gènes non essentiels 3,4. Ce concept a été appliqué à l'échelle génomique produire une carte d'interaction génétique impartiale illustrant comment les gènes impliqués dans les processus cellulaires similaires se regroupent 5.
Perturbations chimiques des réseaux génétiques suppressions de gènes imiter (Figure 1) 6. Interrogation composés inhibiteurs de croissance contre une matrice haute densité de souches de suppression de l'hypersensibilité identifie un profil d'interaction chimique génétique, ce est à dire une liste de gènes qui est nécessaire pour tolérer le stress chimique. Comme les interactions génétiques, grands écrans de bibliothèques chimiques ont montré que les composés avec un mode similaire de se regroupent sept d'action. Par conséquent, en établissant le profil d'interaction chimique génétique d'un composé du mode d'action peut être déduite par comparaison avec large échelle interaction génétique génétique et chimique de synthèse datasets 8,9.
Écrans chimiques génétique à grande échelle, où des dizaines de composés sont interrogés, ont été réalisées par des analyses de la concurrence de codes à barres. Dans cette approche, la collecte groupée des souches de suppression est cultivé en masse depuis plusieurs générations dans un petit volume de milieu contenant un produit chimique. Depuis chaque mutant de suppression recèle un code-barres génétique unique, la viabilité / croissance des mutants individuels au sein du pool de souches de suppression est suivi par microarray ou séquençage à haut débit 10.
Inférer remise en forme en surveillant la taille des colonies de mutants physiquement disposés en réseau cultivés sur gélose solide contenant un composé bioactif est aussi une méthode efficace pour identifier les interactions chimiques-génétiques 11,12. Cette approche offre une alternative rentable au dépistage fondé sur la concurrence et est bien adapté pour le dosage de petites bibliothèques de produits chimiques.Décrite ici est une méthodologie simple pour produire une liste des interactions chimiques-génétiques dans S. cerevisiae qui ne repose pas sur les manipulations moléculaire ou d'infrastructure biologie. Elle exige seulement une collection de levure de suppression, un appareil de brochage robotisé ou manuel, et librement disponibles des logiciels d'analyse d'images.
Protocol
Representative Results
Discussion
Décrit ici est une approche pour générer des profils d'interaction chimiques génétique. La méthode est simple: en comparant les tailles des colonies de chacune des souches dans des collections complètes de deletion de gène en présence et en absence d'un produit chimique, tous les gènes nécessaires pour tolérer une insulte chimique sont identifiés. analyse de l'enrichissement d'annotation de la liste résultant de souches sensibles peut alors être utilisé pour fournir un aperçu d'un mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Recherche dans le laboratoire CJN est soutenu par des subventions de fonctionnement du CRSNG, l'Institut de recherche Société canadienne du cancer (IRSCC), et la Fondation du cancer (Direction BC-Yukon) Canadian Breast.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) – Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12 well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
References
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