화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em> 사카로 미세스 세 레비 시아</em
Summary
Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.
Abstract
생리 활성 화학 물질의 작용 모드를 결정하는 학술, 제약의 넓은 범위에 관심, 산업 과학자이다. 사카로 미세스 세 레비 시아, 또는 신진 효모, 모델 진핵 생물이되는 ~ 6,000 유전자 삭제 돌연변이 hypomorphic 필수 유전자의 전체 모음 돌연변이 체는 시판되고있다. 이러한 돌연변이의 수집 체계적 화학 견딜 필요 유전자 화학적 상호 작용, 즉 유전자를 검출하는데 사용될 수있다. 이 정보는, 차례대로, 화합물의 작용 가능성 모드에보고한다. 여기에서 우리는 효모 신진 화학 – 유전자 상호 작용의 신속한 식별을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 액션의 잘 정의 된 메커니즘이 화학 요법 제 5- 플루오로 우라실 (5-FU)을 사용하는 방법을 보여준다. 우리의 결과는 핵 TRAMP가 엑소 및 DNA 복구 효소 이전 m과 일관성이 5-FU의 존재하에 증식에 필요한 RNA 보여기반 바 코딩 화학 유전 적 접근과 5-FU에 악영향을 모두 RNA 및 DNA 신진 대사에 영향을 미치는 것을 지식을 icroarray. 이러한 높은 처리량 스크린 필요한 검증 프로토콜은 또한 기술된다.
Introduction
유전 도구와 모델 생물 사카로 미세스 세 레비 시아에 이용 가능한 자원 일괄 유전자 네트워크 생물학적 시스템의 요구 사항을 이행하는 방법으로서 기능에 대한 새로운 통찰력을 제공 대규모 기능 유전체학 연구있게되었다. 이러한 도구의 초석은 효모 1, 2의 모든 열려있는 독서 프레임의 비 필수 유전자 결실의 완전한 세트의 공동 제작했다. 눈에 띄는 관찰 표준 실험실 조건에서 haploids로 성장하면 효모의 유전자 만 ~ 20 %가 생존에 필요한 것이 었습니다. 이것은 다른 생물학적 경로의 이용을 통해 게놈 섭동에 대하여 버퍼링 세포의 능력을 강조한다. 유전 개별적으로 가능한 있습니다 돌연변이하지만 조합에 치명적인는 연결 또는 수렴 병렬 생물학적 경로를 신호 및 생물학적 기능을 설명하는 유전자 상호 작용 네트워크를 형성한다. 조건부 TE의 발전과 함께필수 유전자의 mperature에 민감하고 hypomorphic 대립이 기술은 중요하지 않은 유전자 3,4의 연구에 국한되지 않았습니다. 이 개념은 유사한 세포 과정에 관여하는 유전자 (5)가 함께 클러스터링 방법을 설명하는 편견 유전자 상호 작용지도를 생산하는 게놈 규모로 적용되었습니다.
유전자 네트워크의 화학 교란 모방 유전자 결실 (그림 1) 6. 과민성위한 결실 균주의 고밀도 배열 대해 성장 저해 화합물을 조회하면 화학적 스트레스를 허용하는 데 필요한 유전자의리스트, 즉 화학적 상호 작용 유전자 프로파일을 식별한다. 유전 적 상호 작용과 마찬가지로, 화학 라이브러리의 대형 스크린은 액션 함께 클러스터 (7)의 모드를 갖는 화합물과 유사한 것으로 나타났다. 따라서, 화합물의 화학적 상호 작용 유전자 프로파일을 구축하여 작업의 모드는 LAR과 비교하여 추론 할 수있다GE의 규모의 합성 유전자 및 화학 유전자 상호 작용은 8,9 데이터 집합.
화합물의 점수가, 심문하고있는 큰 규모의 화학 유전 스크린, 바코드 경쟁 분석에 의해 수행되었다. 이 방법에서는, 삭제 균주의 풀링 된 컬렉션 화학 물질을 포함하는 미디어의 작은 볼륨에서 여러 세대에 한꺼번에 성장한다. 각 삭제 돌연변이가 고유 한 유전자 바코드를 품고 있기 때문에, 삭제 균주의 풀 내의 개별 돌연변이의 생존 / 성장은 마이크로 어레이 또는 높은 처리량 시퀀싱 (10)에 의해 추적됩니다.
생체 활성 화합물을 함유하는 고체 아가상에서 성장 물리적으로 배열 된 돌연변이 콜로니 크기를 모니터링하여 적응도를 추론하는 것은 화학적 상호 작용 11,12 유전자를 확인하는 효과적인 방법이다. 이 방식은 경쟁 기반 스크리닝에 비용 효율적인 대안을 제공하고, 화학 물질의 작은 라이브러리를 분석하기에 적합하다.여기에 설명 된 S.의 화학적 상호 작용 유전자의리스트를 생성하기위한 간단한 방법이다 생물학 조작 또는 인프라 분자에 의존하지 않는 cerevisiae의는. 그것은 단지 효모 삭제 수집, 로봇 또는 수동 피닝 장치 및 무료로 사용할 이미지 분석 소프트웨어가 필요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
화학적 상호 작용 유전자 프로파일을 생성하기위한 방법이 여기에 설명했다. 방법은 간단하다 화학의 유무에 광범위한 유전자 결실 컬렉션 각 균주의 콜로니 크기를 비교하여, 화학적 내성 모독에 필요한 모든 유전자들은 식별된다. 민감한 균주의 결과 목록의 주석 농축 분석은 화학 물질의 작용 모드에 대한 통찰력을 제공하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 효모 신진 위해 최적화되어 있?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CJN 실험실에서 연구 NSERC, 캐나다 암 협회 연구소 (CCSRI)와 캐나다 유방암 재단 (BC-유콘 지점)에서 운영 보조금 지원됩니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) – Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12 well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
References
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
- Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
- Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
- Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
- Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
- Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
- Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
- Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
- Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
- Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
- Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
- Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
- Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
- Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).
