Un guide pour générer et utiliser hiPSC PNJ dérivés pour l'étude des maladies neurologiques

Summary

This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

Abstract

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.

Introduction

des études d'expression génique de neurones différenciés in vitro à partir de cellules souches pluripotentes d'origine humaine (les) hiPSCs par nous et d'autres ^{1 2,3} indiquent que les neurones hiPSC ressemblent foetal plutôt que le tissu cérébral adulte. À l'heure actuelle, les modèles fondés sur hiPSC peuvent être plus appropriées pour l'étude de prédisposition à, plutôt que de caractéristiques tardive de la maladie neurologique. Nous avons précédemment rapporté que une fraction significative de la signature de gène de neurones hiPSC dérivé schizophrénie est conservée dans les cellules de la schizophrénie de hiPSC dérivé progénitrices neurales (CNP), indiquant que CPN peut être un type cellulaire utile pour étudier les mécanismes moléculaires qui contribue à la schizophrénie ¹ . Nous et d'autres avons signalé la migration aberrante, augmentation du stress oxydatif et les espèces réactives de l'oxygène, la sensibilité à la sous-seuil stress environnementaux et la fonction mitochondriale altérée dans la schizophrénie hiPSC PNJ ^1,4-6, ainsi qu'une diminution de c neuronaleonnectivit é et la fonction synaptique dans les neurones de la schizophrénie hiPSC ^5,7-10. Si les facteurs moléculaires contribuent à la migration aberrante et / ou le stress oxydatif dans la schizophrénie hiPSC PNJ sous-tendent également la connectivité neuronale réduite dans les neurones hiPSC dérivés schizophrénie, PNJ pourraient être une population de neurones robuste et très réplicative avec lequel pour étudier les mécanismes responsables de la maladie. En outre, parce que l'on peut générer rapidement un grand nombre de cellules et ne doivent pas attendre des semaines ou des mois pour la maturation neuronale, tests basés sur PNJ sont adaptés pour l'étude de cohortes de patients plus importants et sont plus disposés à criblage à haut débit. Nous croyons que hiPSC PNJ peut servir comme un proxy pour les voies de développement susceptibles de contribuer à la pathogenèse de la maladie, comme cela a déjà été démontré dans de troubles aussi divers que la schizophrénie ¹ et la maladie de Huntington ^11.

Pour différencier les PNJ de se hiPSCs, neurale initialela production est réalisée par double inhibition SMAD (0,1 mM et 10 mM LDN193189 SB431542) ^12. En se opposant BMP et TGF signalisation avec ces petites molécules, l'endoderme et du mésoderme spécification est bloquée, ce qui accélère la différenciation neuronale et conduisant à la formation de rosettes de neurones visibles dans la semaine de placage. Neural motif se produit au début de ce processus, probablement au cours de la période de la formation de rosettes de neurones et immédiatement après. En l'absence d'autres indices, ces cellules nerveuses primitives supposent un cerveau antérieur comme le destin ^{antérieure-13.} Immédiatement après la formation de rosettes de neurones, et continue tout au long de l'expansion de l'APN, PNJ cerveau antérieur sont cultivées avec FGF2 ^8,14. Ils ont le potentiel de la lignée double et peuvent être différenciés aux populations de neurones de 70-80% neurones III-tubuline-positifs et de 20 à 30% protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) astrocytes -positifs (Figure 1). La majorité des neurones du cerveau antérieur hiPSC sont VGLUT1 positif, Et sont donc vraisemblablement glutamatergique, même si environ 30% des neurones sont GAD67 positif (GABAergique) ^8.

PNJ sont régulièrement soumises à des passages plus de dix fois in vitro, tout en maintenant des profils de différenciation cohérentes et sans accumuler des anomalies du caryotype. Groupes ont rapporté PNJ de passages plus de 40 fois ^15, cependant, nous constatons que plus de dix passages, PNJ montrent propension accrue à la différenciation des astrocytes. PNJ bien tolérer plusieurs gel-dégel et peut être la transition de croître comme neurosphères simplement en culture dans des plaques non-adhérentes. PNJ sont efficacement transduites par des vecteurs viraux, permettant l'évaluation rapide des conséquences moléculaires et cellulaires de la perturbation génétique et facilement extensible pour obtenir suffisamment de matériel pour les études biochimiques. En outre, en raison des vecteurs viraux permettent robuste sur-expression et / ou inactivation de gènes responsables de maladies concerné, soit le contrôle ou le patient dérivée neural cellules, on peut utiliser cette plateforme pour tester l'effet de fond génétique sur ces manipulations. Bien que ne convient pas pour synaptique ou tests basés sur les activités nécessitant neurones matures, PNJ peut être une alternative pratique pour de nombreuses analyses moléculaires ou biochimiques simples de cellules neurales provenant de patients.

Protocol

1. hiPSC différenciation de cellules progénitrices neurales Grandir et se développer hiPSCs dans les cellules souches embryonnaires humaines (HES) médias (tableau 1) co-cultivées sur une fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) de couche d'alimentation jusqu'à ce que les grandes (mais subconfluentes) colonies sont prêts pour la différenciation neuronale via un corps embryoïdes (EB) intermédiaire (Figure 2). Conditions de culture de routine hiPSC sont bien …

Representative Results

Rosettes de neurones peuvent être identifiées morphologiquement en utilisant un microscope à fond clair, par leur aspect caractéristique en tant que clusters de cellules neuro-épithéliales rondes avec polarité apico-basale (Figure 1). Bien que les PNJ sont généralement cultivées à très haute densité cellulaire, immédiatement après repiquage, légèrement soma forme pyramidale et la structure bipolaire neurites est visible (figure 1D). PNJ validées expriment la nestine et…

Discussion

Nous avons décrit les méthodes permettant de différencier hiPSCs dans PNJ, un type de cellules neurales dans laquelle une fraction importante de la signature génétique des neurones hiPSC dérivés est conservée et que peuvent servir comme un proxy pour les voies de développement susceptibles de contribuer à la maladie pathogenèse ^{8, 11.} En outre, comme nous l'avons précisé, les PNJ sont une population de neurones robuste réplicative et facilement transduites, qui nous croyons peut être approp…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Life Technologies	#11330	for HES media
DMEM/F12	Life Technologies	#10565	for neural media
KO-Serum Replacement	Life Technologies	#10828	Needs to be lot tested
Glutamax	Life Technologies	#35050
NEAA	Life Technologies	#11140
2‐mercaptoethanol (55mM 1000x)	Life Technologies	#21985-023
N2	Life Technologies	#17502-048	Needs to be lot tested
B27-RA	Life Technologies	#12587-010	Needs to be lot tested
FGF2	Life Technologies	#13256-029	Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189	Stemgent	#04-0074
SB431542	Stemgent	#04-0010
BDNF	Peprotech	#450-02	Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF	Peprotech	#450-10	Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP	Sigma	#D0627	Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid	Sigma	#A0278	Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent	Stemcell Technologies	#05832
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT-104
Collagenase IV	Life Technologies	#17104019
CF1 mEFs	Millipore	#PMEF-CF
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655
Laminin, Natural Mouse 1mg	Life Technologies	#23017-015
BD Matrigel	BD	#354230	Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates	Corning	3506
Ultra low attachment 6-well plates	Corning	3471
goat anti-Sox2	Santa Cruz	sc­17320	use at 1:200
mouse anti-human Nestin	Millipore	MAB5326	use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin	Covance	PRB­435P	use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin	Covance	MMS­435P	use at 1:500
mouse anti-MAP2AB	Sigma	M1406	use at 1:200
Plate centrifuge	Beckman Coulter	Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)