신경 질환의 연구에 대한 생성 및 사용 hiPSC 파생 NPC들에 가이드
Summary
This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.
Abstract
Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.
Introduction
우리 (1)에 의해 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에서 시험 관내에서 차별화 된 신경 세포 등, 3의 유전자 발현 연구는 hiPSC 신경 세포가 태아보다는 성인 뇌 조직을 닮은 것을 나타냅니다. 현재, hiPSC 기반 모델은 오히려 늦은 기능, 신경 학적 질병보다에 경향의 연구에 더 적합 할 수있다. 우리는 이전의 NPC 분열증 한 기여 분자 경로를 연구하는데 유용한 세포 유형이 될 수 있다는 것을 나타내는, 정신 분열증 hiPSC 유래 신경 세포의 유전자 서명의 상당 부분이 정신 분열증 hiPSC 유래 신경 전구 세포 (NPC들)에 보존되었다고보고했다 . 우리와 다른 비정상적인 이주 증가 산화 스트레스 및 반응성 산소 종, 서브 – 임계 환경 스트레스 및 정신 분열증에서 미토콘드리아 기능 부전의 NPC hiPSC 1,4-6 민감도뿐만 아니라 C를 감소 신경 신고되었습니다연 결 성 및 정신 분열증 hiPSC 신경 5,7-10에서 시냅스 기능. 정신 분열증 hiPSC의 NPC에서 벗어난 마이그레이션 및 / 또는 산화 스트레스에 기여하는 분자 요인 또한 정신 분열증 hiPSC 유래 신경 세포의 감소 된 신경 세포의 연결을 기초 경우, NPC의 질병을 담당하는 메커니즘을 연구하는과 강력하고 매우 복제 성 신경 인구 수 있습니다. 하나는 신속하게 많은 수의 세포를 생성 할 수 있습니다 및 신경 세포의 성숙을 위해 몇 주 또는 몇 달을 기다릴 필요가 있기 때문에 또한, NPC 기반의 분석은 큰 환자 코호트 연구에 적합하며 높은 처리량 검사에 더 의무가 있습니다. 우리는 이미 정신 분열증 1 헌팅턴 병 (11) 등 다양한 질환에서 입증 된 바와 같이 hiPSC의 NPC, 잠재적으로 질병의 발병에 기여하는 발달 경로에 대한 프록시 역할을 할 수 있다고 생각합니다.
hiPSCs에서 초기 신경에서의 NPC를 구분하기 위해duction 듀얼 SMAD 억제 (위하여 0.1mM LDN193189 및 10 mM이 SB431542) (12)에 의해 달성된다. 이러한 작은 분자 신호 BMP 및 TGF 반감으로 내배엽과 중배엽 사양은 신경 세포의 분화를 가속화하고 도금의 1 주일 이내에 볼 신경 로제트의 형성을 선도 차단됩니다. 신경 패터닝 아마도 그 후 즉시 신경 로제트 형성 및 기간 동안, 초기에이 과정에서 발생한다. 다른 단서가없는 경우, 이들 신경 원시 세포는 전뇌 전방 형상 (13)의 운명을 가정한다. 즉시 신경 로제트 형성을 다음과 NPC 확장에 걸쳐 진행, 전뇌의 NPC FGF2 8, 14 배양한다. 그들은 이중 혈통 잠재력을 가지고 70~80% III-tubulin에 양성 신경 세포와 20 ~ 30 % glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 양성 성상 세포 (그림 1)의 신경 인구로 구분 될 수있다. 전뇌 hiPSC 뉴런의 대부분 VGLUT1 양성신경 세포의 약 30 %가 GAD67 양성 (GABA 성) 있지만, 그래서, 아마도 글루탐산이다 (8).
NPC가 일상적으로 일관된 차별화 프로파일을 유지하고, 염색체 이상을 축적하지 않고있는 동안, 시험관 내에서 10 배 이상 계대. 그룹 계대 엔피씨 (15)는, 그러나, 우리 10 구절을 넘어, 엔피씨가 성상 세포 분화 경향이 커지고있다 찾을보다 40 배 신고되었습니다. NPC의 여러 동결 해빙을 잘 견딜 단순히 비 접착 성 판에서 배양하여 neurosphere를로 성장으로 전환 할 수 있습니다. NPC가 효율적 생화학 연구를 위해 충분한 물질을 수득 신속한 유전 섭동 분자 세포의 평가 결과, 쉽게 확장을 가능 바이러스 벡터로 형질 도입된다. 또한, 때문에 바이러스 벡터는 허용 강력한 과발현 제어 또는 환자 파생 neur 중 및 / 또는 질병 관련 유전자의 최저,알 세포는 하나의 이러한 유전 적 조작에 대한 배경의 영향을 테스트하기 위해이 플랫폼을 사용할 수있다. 시냅스 또는 성숙한 뉴런을 필요로하는 활동 기반의 분석에 적합하지 않지만, NPC의 환자 유래 신경 세포의 많은 간단한 분자 또는 생화학 적 분석을위한 실용적인 대안이 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 NPC들에 hiPSCs는 신경 세포의 종류가있는 hiPSC 유래 신경 세포의 유전자 서명의 상당 부분이 보존되고 그 잠재적으로 질병의 발병 기전 (8)에 기여하는 발달 경로에 대한 프록시 역할을 할 수있다 구별하는 기준에 방법을 설명했다 (11). 우리가 자세히 것처럼 또한, NPC가 우리가 질병 소인의 분자 생화학 적 연구에 적합 할 수있다 생각 견고 복제 성 쉽게 형질 신경 인?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation – Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | for HES media |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | for neural media |
| KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Needs to be lot tested |
| Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
| NEAA | Life Technologies | #11140 | |
| 2‐mercaptoethanol (55mM 1000x) | Life Technologies | #21985-023 | |
| N2 | Life Technologies | #17502-048 | Needs to be lot tested |
| B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Needs to be lot tested |
| FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Resuspend in PBS + 1% BSA |
| LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
| SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
| BDNF | Peprotech | #450-02 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| GDNF | Peprotech | #450-10 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| Dibutyryl cyclic-AMP | Sigma | #D0627 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| L-ascorbic acid | Sigma | #A0278 | Resuspend in H20 |
| STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent | Stemcell Technologies | #05832 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
| CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Laminin, Natural Mouse 1mg | Life Technologies | #23017-015 | |
| BD Matrigel | BD | #354230 | Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent |
| Tissue culture treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Ultra low attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| goat anti-Sox2 | Santa Cruz | sc17320 | use at 1:200 |
| mouse anti-human Nestin | Millipore | MAB5326 | use at 1:200 |
| rabbit anti-βIII-tubulin | Covance | PRB435P | use at 1:500 |
| mouse anti-βIII-tubulin | Covance | MMS435P | use at 1:500 |
| mouse anti-MAP2AB | Sigma | M1406 | use at 1:200 |
| Plate centrifuge | Beckman Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier) |
References
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