Um Guia para a geração e uso hiPSC NPCs derivados para o Estudo das Doenças Neurológicas
Summary
This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.
Abstract
Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.
Introduction
Estudos de neurônios diferenciadas in vitro a partir de humanos células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs) por nós 1 e outros 2,3 de expressão de genes indicam que os neurônios hiPSC assemelhar fetal em vez de adulto tecido cerebral. Actualmente, os modelos baseados em hiPSC pode ser mais adequado para o estudo da predisposição para, em vez de funções tardias da doença, neurológica. Nós já relataram que uma fracção significativa do gene assinatura de esquizofrenia neurónios derivados de hiPSC é conservado em células derivadas de esquizofrenia hiPSC progenitoras neurais (NPCs), indicando que NPCs pode ser um tipo de células útil para o estudo das vias moleculares que contribui para uma esquizofrenia . Nós e outros relataram migração aberrante, aumento do estresse oxidativo e espécies reativas de oxigênio, a sensibilidade a estresses ambientais sub-limiar e função mitocondrial prejudicada na esquizofrenia hiPSC NPCs 1,4-6, bem como a diminuição neuronal conectividade e função sináptica em neurônios esquizofrenia hiPSC 5,7-10. Se os factores moleculares que contribuem para a migração aberrante e / ou stress oxidativo na esquizofrenia hiPSC NPCs também estão na base da conectividade neuronal reduzido na esquizofrenia neurónios derivados de hiPSC, NPCs poderia ser uma população neural robusto e altamente replicativo com que para estudar os mecanismos responsáveis pela doença. Além disso, porque pode-se gerar rapidamente grandes números de células e não precisam de esperar semanas ou meses para maturação neuronal, ensaios baseados em NPC são adequados para o estudo de coortes de pacientes e maiores são mais passíveis de rastreio de alto rendimento. Acreditamos que hiPSC NPCs pode servir como um proxy para as vias de desenvolvimento potencialmente contribuem para a patogênese da doença, como já foi demonstrado em desordens tão diversas como a esquizofrenia 1 e doença de Huntington doença 11.
Para diferenciar NPCs hiPSCs, neural inicial emprodução é conseguida através da inibição de dupla SMAD (0,1 mM e 10 mM LDN193189 SB431542) 12. Antagonizando BMP e TGF sinalização com estas pequenas moléculas, endoderme e mesoderme especificação é bloqueado, acelerar a diferenciação neuronal e levando à formação de rosetas neurais visíveis dentro de uma semana de chapeamento. Padronização neural ocorre no início deste processo, presumivelmente, no período de formação de rosetas neural e imediatamente a seguir. Na ausência de outros sinais, estas células neurais primitivas assumir um destino prosencéfalo como anterior-13. Imediatamente após a formação de rosetas neural, e contínuo ao longo da expansão NPC, NPCs frontais do cérebro são cultivadas com FGF2 8,14. Eles têm potencial linhagem dupla e podem ser diferenciadas de populações neurais de 70-80% neurónios III-tubulina-positivos e 20-30% de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) -positivas astrócitos (Figura 1). A maioria dos neurônios do cérebro anterior hiPSC são VGLUT1-positivo, E por isso são presumivelmente glutamatérgica e aproximadamente 30% dos neurónios estão GAD67-positivo (GABAérgica) 8.
NPCs são rotineiramente passadas mais do que dez vezes in vitro, mantendo ao mesmo tempo perfis de diferenciação consistentes, e sem acumulação de anormalidades do cariótipo. Grupos têm relatado NPCs Passaging mais de 40 vezes 15, no entanto, descobrimos que mais de dez passagens, NPCs mostram aumento da propensão para a diferenciação de astrócitos. NPCs bem tolerar múltiplas Freeze-descongela e pode ser transferida para crescer como neurospheres simplesmente o cultivo em placas não aderentes. NPCs são eficientemente transduzidas por vectores virais, permitindo uma rápida avaliação das consequências moleculares e celulares da perturbação genética, e facilmente expansível para se obter material suficiente para estudos bioquímicos. Além disso, porque os vectores virais permitir robusta sobre-expressão e / ou eliminação de genes relevantes a doença, em qualquer controlo ou paciente derivado neural células, pode-se usar esta plataforma para testar o efeito de fundo genético nessas manipulações. Apesar de não ser adequado para sináptica ou ensaios baseados em atividades que exigem neurônios maduros, NPCs pode ser uma alternativa prática para muitas análises moleculares e bioquímicas diretas de células neurais derivadas de pacientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos métodos pelos quais a diferenciar hiPSCs em NPCs, um tipo de célula neural em que uma fração significativa da assinatura gene de neurônios hiPSC derivados é conservada e que pode servir como um proxy para as vias de desenvolvimento potencialmente contribuem para a patogênese da doença 8, 11. Além disso, como já detalhado, NPCs são uma população neural robustamente replicativo e facilmente transduzidas, que acreditamos que pode ser adequado para estudos moleculares e bioquímicos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation – Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | for HES media |
| DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | for neural media |
| KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Needs to be lot tested |
| Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
| NEAA | Life Technologies | #11140 | |
| 2‐mercaptoethanol (55mM 1000x) | Life Technologies | #21985-023 | |
| N2 | Life Technologies | #17502-048 | Needs to be lot tested |
| B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Needs to be lot tested |
| FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Resuspend in PBS + 1% BSA |
| LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
| SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
| BDNF | Peprotech | #450-02 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| GDNF | Peprotech | #450-10 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| Dibutyryl cyclic-AMP | Sigma | #D0627 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
| L-ascorbic acid | Sigma | #A0278 | Resuspend in H20 |
| STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent | Stemcell Technologies | #05832 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
| CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Laminin, Natural Mouse 1mg | Life Technologies | #23017-015 | |
| BD Matrigel | BD | #354230 | Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent |
| Tissue culture treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Ultra low attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
| goat anti-Sox2 | Santa Cruz | sc17320 | use at 1:200 |
| mouse anti-human Nestin | Millipore | MAB5326 | use at 1:200 |
| rabbit anti-βIII-tubulin | Covance | PRB435P | use at 1:500 |
| mouse anti-βIII-tubulin | Covance | MMS435P | use at 1:500 |
| mouse anti-MAP2AB | Sigma | M1406 | use at 1:200 |
| Plate centrifuge | Beckman Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier) |
References
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