Photopatterning البروتينات والخلايا في وسط مائي البيئة عن طريق تيو<sub> 2</sub> ضوئي
Summary
We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.
Abstract
الملوثات العضوية كثف على السطح من ثاني أكسيد التيتانيوم (تيو 2) يمكن أن تتحلل عن طريق تحفيز ضوئي تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) النور. نحن هنا وصف بروتوكول رواية توظيف تحفيز ضوئي تيو 2 لتغيير محليا تقارب خلية من سطح الركيزة. لهذه التجربة، وكان رقيق تيو 2 فيلم على ساترة الزجاج المطلي تفل، وتم تعديل سطح تيو 2 في وقت لاحق مع أحادي الطبقة organosilane المستمدة من octadecyltrichlorosilane (OTS)، الذي يمنع التصاق الخلية. تم مغمورة العينة في مستنبت الخلية، وركز تم المشع ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى منطقة مثمنة. عندما كانت مطلية على الخلايا PC12 خط الخلية العصبية على العينة، خلايا التقيد فقط على منطقة المشع للأشعة فوق البنفسجية. وتبين لنا أيضا أن هذا التعديل السطح ويمكن أيضا أن يؤديها في الموقع، أي حتى عندما الخلايا تنمو على الركيزة. التعديل المناسب للسطح المطلوب مصفوفة ص خارج الخليةrotein الكولاجين ليكون حاضرا في المتوسط في وقت اشعة فوق البنفسجية. تقنية المعروضة هنا يمكن أن يحتمل استخدامها في الزخرفة أنواع خلايا متعددة لبناء أنظمة coculture أو التلاعب تعسفية الخلايا تحت الثقافة.
Introduction
عمليات أشباه الموصلات الطباعة الحجرية ومشتقاته – مثل 1،2 ضوئيه، شعاع الإلكترون الطباعة الحجرية 3-6، وmicrocontact طباعة 10/07 – أصبحت الآن أداة أنشئت في بيولوجيا الخلية في النمو الخلايا الحية في وضع تعريف والهندسة. يعتمد أسلوب الزخرفة على استخدام ركائز microfabricated، تتكون من جزيرة صغيرة من الخلايا طلاء متساهل في الخلفية غير متساهلة. تخدم هذه الركيزة كقالب لنمط الخلايا. وقد وفرت هذه التقنيات لنا طرق جديدة لهندسة الخلايا وظيفتها على مستوى أحادية ومتعددة الخلايا، لاستخراج الخصائص الجوهرية للخلايا، وزيادة الإنتاجية من خلية القاعدة المخدرات فحص 11.
ان درجة-الحرية في الزخرفة الخلية زيادة كبيرة إذا كان من الممكن تغيير هندسة نمط القالب في الموقع، أي في حين أن الخلايا يتم تربيتها على الصورةurface. الأساليب التقليدية لتشكيل نمط لا يمكن تطبيقها مباشرة هنا، لأنها معالجة العينات في الجو أو في فراغ. وقد اقترحت مختلف بالتالي تقنيات تعديل السطح الجديدة، والتي تقوم، على سبيل المثال، على مركبات photoreactive 12،13 أو ليزر الاجتثاث 5،14، على سبيل المثال لا الحصر. وقد تم استعراض الأساليب المقترحة لطيف من قبل روبرتوس وآخرون 15، ومؤخرا من قبل تشوي وآخرون. 16 وناكانيشي 17.
هنا في هذه المقالة، نحن تصف بروتوكول رواية في الموقع تعديل السطح، الذي يستفيد من التحلل بهوتوكاتاليتيك من الجزيئات العضوية على ثاني أكسيد التيتانيوم (تيو 2) سطح 18،19. في هذه الطريقة، يتم إدراج فيلم تيو 2 بين الركيزة الزجاج والفيلم العضوية التي واجهات الخلايا، وتتحلل الفيلم العضوية في الموقع عن طريق تشعيع محليا فوق البنفسجية (UV)ضوء على المنطقة ذات الاهتمام (λ <388 نانومتر). وتبين لنا أن البروتوكول الجديد يمكن أن تستخدم لخلق micropatterns من البروتينات المصفوفة خارج الخلية والخلايا الحية على حد سواء خارج الموقع والموقع. تيو 2 متوافق حيويا ومستقر كيميائيا، وشفافة بصريا، ملامح مما يجعلها صديقة ليعرض في تجارب لزراعة الخلايا. يوفر هذا البروتوكول بديل المواد على أساس علمي لتعديل السقالات خلية الثقافة في بيئة خلية الثقافة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في البروتوكول الحالي لدينا، تشكلت تيو 2 فيلم RF-المغنطرون الاخرق. نحن نؤيد هذا الأسلوب من ترسب لأنه يسمح لنا لإعداد بتكاثر على بهوتوكاتاليتيك تيو 2 فيلم مع خشونة نانومتر الفرعي. على الرغم من أن عمليات ترسيب بالرش مألوفة للعلماء والمهندسين المواد الإلكترون?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors thank Mr. Kotaro Okubo for the kind assistance with SEM imaging. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021), and by research grants from the Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation and the Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.
Materials
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) |
Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 mm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 mm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
- Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
- Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).
- Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
- Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).
- Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
- Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
- Deka, G., Okano, K., Kao, F. -. J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).
- Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
- Choi, I., Yeo, W. -. S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
- Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
- Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021 (2014).
- Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
- Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
- Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
- Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
- Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
