Photopatterning белки и клетки в водной среде, используя TiO<sub> 2</sub> Фотокатализ
Summary
We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.
Abstract
Органические примеси, адсорбированные на поверхности диоксида титана (TiO 2) можно разложить на фотокатализа при ультрафиолетовом (УФ) свете. Здесь мы опишем протокол, использующую новый TiO 2 фотокатализ локально изменять сродство клеток поверхности подложки. Для этого эксперимента, тонкий TiO 2 фильм был покрытым напылением на стекло покровное, и поверхность TiO 2 были внесены изменения с кремнийорганическим монослоя, полученного из octadecyltrichlorosilane (OTS), который ингибирует клеточную адгезию. Образец погружали в среду для культивирования клеток, и целенаправленный ультрафиолетового света облучали с восьмиугольной области. Когда нейрональные клетки линии РС12 клетки высевают на образце, клетки придерживались только на области УФ-облучении. Кроме того, мы показали, что эта поверхность модификации могут быть выполнены на месте, то есть, даже когда клетки растут на подложке. Правильное модификация поверхности необходимо внеклеточного матрикса рrotein коллаген присутствовать в среде в момент УФ-облучения. Техника, представленная здесь может потенциально быть использованы в нескольких паттерна типов клеток для построения совместного культивирования системы или произвольно манипулировать клетки под культуры.
Introduction
Полупроводниковые литографии процессы и ее производные, такие как – фотолитографии 1,2, электронно-лучевой литографии 3-6 и 7-10 микроконтакта печати – стали теперь установлено инструментом в клеточной биологии расти живые клетки в определенном положении и геометрии. Способ формирования рисунка зависит от использования микроизготовленном подложек, состоящий из микро-острове клеток разрешающей покрытия в непермиссивной фоне. Такой субстрат служит в качестве шаблона для модели клетки. Эти технологии при условии, нам новые способы для конструирования клеток и их функции в одно- и мульти-клеточном уровне, чтобы извлечь внутренние свойства клеток, а также увеличить пропускную способность на основе клеток скрининга лекарственных средств 11.
Степень-о-свободы в клеточной паттерна бы значительно увеличить, если геометрия модели шаблона могут быть изменены на месте, то есть, в то время как клетки культивируют на Surface. Обычные методы формирования рисунка не могут быть непосредственно применены здесь, так как они обрабатывают образцы в атмосфере или в вакууме. Поэтому различные новые методы модификации поверхности были предложены, которые основаны, например, на фотореакционноспособных соединений 12,13 или лазерной абляции 5,14, только чтобы назвать несколько. Предложенные методы были хорошо рассмотрены Robertus др. 15, а в последнее время Чой и др. 16 и 17 Nakanishi.
Здесь, в этой статье мы опишем новый протокол на месте модификации поверхности, которая принимает преимущество фотокаталитического разложения органических молекул на диоксид титана (TiO 2) поверхности 18,19. В этом методе, пленка TiO 2 вставляется между стеклянной подложкой и органическую пленку, который взаимодействует клетки, и органическая пленка разлагается на месте путем облучения локально ультрафиолетового (УФ)свет в интересующей области (λ <388 нм). Покажем, что новый протокол может быть использован для создания micropatterns белков внеклеточного матрикса и живых клеток обоих ex-situ и на месте. TiO 2 является биологически совместимым, химически стабильный, и оптически прозрачной, особенности, что делает его удобным ввести в экспериментам с культурой клеток. Этот протокол обеспечивает материалы на основе науки альтернативу для изменения клеточной культуры каркасов в среде культивирования клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
В нашем протоколе, TiO 2, фильм был сформирован РФ-магнетронного распыления. Мы выступаем этот метод осаждения, так как это позволяет нам воспроизводимо приготовить фотокаталитический TiO 2 фильма с суб-нм шероховатости. Хотя НАПЫЛЕНИЕМ процессы осаждения знакомы материалов у?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors thank Mr. Kotaro Okubo for the kind assistance with SEM imaging. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021), and by research grants from the Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation and the Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.
Materials
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) |
Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 mm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 mm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
- Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
- Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).
- Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
- Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).
- Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
- Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
- Deka, G., Okano, K., Kao, F. -. J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).
- Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
- Choi, I., Yeo, W. -. S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
- Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
- Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021 (2014).
- Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
- Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
- Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
- Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
- Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
