Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

Summary

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Abstract

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Introduction

Eiwit-eiwit interacties (PPI) zijn van fundamenteel belang voor de biologie ^{1 en} zijn strak gereguleerd via spatiotemporele mechanismen heel veel tijd en lengteschalen. Studies on cell signaling op het celmembraan, bijvoorbeeld, zijn dynamische, nanoschaal ruimtelijke compartimenten specifieke PPI en cellulaire processen ² vergemakkelijken geopenbaard. Vandaar dat de mogelijkheid om protonpompremmers in biologische systemen sonde met voldoende ruimtelijke en temporele resolutie, hoge specificiteit en hoge gevoeligheid is de sleutel tot het bereiken van een mechanistisch begrip van de biologie.

Bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) is één van de weinige bestaande instrumenten voor het visualiseren van PPI's in een cel met subcellulaire resolutie en live-cell compatibiliteit ^3-5. De techniek is relatief eenvoudig en omvat splitsing van een fluorescentie-eiwit in twee niet-fluorescerende fragmenten; wanneer genetisch gelabeld twee interagerende eiwitten enin de nabijheid komt, kunnen de fragmenten reconstrueren tot een volledig fluorescent eiwit vormen, waarbij fluorescent signaal. Indien juist ontworpen, mag BiFC probes niet spontaan reconstitueren in afwezigheid van protonpompremmers. Als zodanig zal het fluorescentiesignaal in een BiFC assay alleen voordoen in aanwezigheid van protonpompremmers, die directe visualisatie van protonpompremmers met hoge specificiteit mogelijk maakt. Bijkomende voordelen van het gebruik van fluorescentie als uitlezing zijn hoge gevoeligheid, subcellulaire resolutie, en compatibiliteit met hoge doorvoer en hoge gehalte screeningstesten, onder anderen. Om deze voordelen is een aantal BiFC probes op basis van verschillende bovenliggende fluorescente proteïnen ontwikkeld. Zoals in alle andere detectietechnieken gebaseerd op conventionele lichtmicroscopie echter de ruimtelijke resolutie van BiFC beperkt tot ~ 250 nm door diffractie van licht. Dit maakt het een uitdaging om de regulering van de PPI's bestuderen op nanoschaal, die, zoals eerder gezinspeeld en geïllustreerd door lipid rafts ⁶ and Ras nanoclusters ^7, is een kritische lengte schaal om het begrijpen van vele cellulaire processen zoals signalering.

BiFC is gecombineerd met fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) ^8,9 om deze limiet in de ruimtelijke resolutie te overwinnen voor het afbeelden van PPI ^10. PALM is een recente superresolutiemicroscopie techniek die de diffractielimiet in fluorescentie beeldvorming door middel van stochastische activering en subdiffractive lokalisatie van enkele fluorescerende moleculen omzeilt. In elke cyclus activatie, een fluorescent molecuul geeft een paar honderd tot een paar duizend fotonen en geeft aanleiding tot een enkel beeld molecule op de detector. Terwijl het beeld buigingsbegrensde (~ 250 nm breed), het zwaartepunt kan worden bepaald met een veel hogere nauwkeurigheid, typisch in de orde van 10-50 nm afhankelijk van het aantal gedetecteerde fotonen. Door het activeren en het lokaliseren van elke fluorescerende moleculen in het monster, kan een hoge resolutie worden gereconstrueerd. Performed op levende cellen, enkel molecuul volgen (smt-) PALM verdere vergunningen overname van duizenden eiwit diffusie trajecten van een enkele cel ^11. Belangrijk PALM gebruikt gespecialiseerde fluorescente probes zoals activeerbare fluorescente eiwitten (PA-KP) stochastische activatie bereiken. Aangezien zowel BiFC en PALM gebruik fluorescerende eiwitten, werden zij gecombineerd door het splitsen PAmCherry1, een veelgebruikte PA-FP voor PALM, in twee fragmenten tussen aminozuren 159 en 160.

Het BiFC systeem op basis van split PAmCherry1 toont lage achtergrond signaal van spontane reconstructie van de twee fragmenten. Bij genetisch gelabeld met een paar interagerende eiwitten, de twee fragmenten (RN = residuen 1-159; RC = Met + residuen 160-236) efficiënt gereconstitueerd volledige PAmCherry1 eiwitten ook bij 37 ° C en zonder incubatie bij lagere temperaturen ontstaan, waardoor is niet het geval voor andere BiFC paren ^12, zoals de ouder mCherry ^13. Furthermoopnieuw, de opgeloste PAmCherry1 eiwit behield de fotofysische eigenschappen van de moedermaatschappij PAmCherry1, zoals hoge contrast ratio, medium foton opbrengst, en snel fotoactivatie, onder anderen, die kritisch zijn voor accurate single molecule lokalisatie en hoge-resolutie PALM beeldvorming zijn.

In dit protocol, het gebruik van BiFC-PALM voor beeldvorming van Ras-Raf interacties in U2OS cellen door het gebruik van split PAmCherry1 (figuur 1A) wordt beschreven. De eerste stap is om de constructen te ontwerpen voor expressie fusieproteïnen tussen PAmCherry1 fragmenten (dat wil zeggen, RN en RC) en de eiwitten van belang. In theorie, voor elk paar kandidaateiwitten (A en B) zijn er acht paren fusie-eiwitten te onderzoeken: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; en A-RC / B-RN. Deze werkwijze kan vaak worden vereenvoudigd door rekening te houden met de structurele of biochemische eigenschappen van de kandidaat eiwitten. Bij Ras, het eiwitpost-translationeel gemodificeerd aan het C-terminale CAAX box (C = Cys; A = alifatisch; X = elk), waarna de AAX motief wordt afgesplitst. Vandaar RN of RC kan alleen worden gefuseerd aan de N-terminus van Ras; dit vermindert het aantal fusieproteïne paren vier (Figuur 1B). Voor Raf, de Ras-bindend domein (RBD; resten 51-131) wordt gebruikt en kan worden gelabeld aan beide zijden. Deze vier fusion configuraties werden gegenereerd: RN-KRAS / RC-Raf RBD; RN-KRAS / Raf RBD-RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; en RC-KRAS / Raf RBD-RN.

Bovendien zal de linker tussen de fragmenten en de eiwitten van belang te worden overwogen. Een flexibele linker van ongeveer tien aminozuren wordt vaak gebruikt omdat het voldoende vrijheid complementatie optreden. Een dergelijke linker is (GGGGS) x2, maar er zijn vele anderen die met succes zijn toegepast, met inbegrip van willekeurige sequenties gegenereerd uit een meervoudige kloneringsplaats (MCS) ^14. De lengte van de linkers moet mogelijk worden geoptimaliseerd DependinG van de grootte van de eiwitten van belang en de oriëntaties in de omgang.

De PAmCherry1 fragmenten worden opgenomen in een kleine klonen backbone met flankerende MCSs (zie Materials List). Genen van belang kan worden ingebracht via de restrictieplaatsen of een ligatie onafhankelijke methode. Na kloneren en sequentieverificatie, wordt de expressiecassette overgebracht in een expressievector onder toepassing van een recombinase reactie, een klonen met hoge betrouwbaarheid en hoge efficiency.

Vervolgens worden de resulterende expressieconstructen getransfecteerd in de doelwitcellijn of, indien een stabiele cellijn is gewenst, verpakt in lentivirus voor het infecteren van de doelcellijn. Transiënte transfectie maakt een snelle validatie van de BiFC configuraties, maar potentiële problemen worden aangehouden. Transfectie met behulp van chemicaliën vaak benadrukt de cellen, wat resulteert in hoge autofluorescentie; terwijl het gebruik van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) Micrpy kan deze achtergrond signaal te verzachten door het beperken van de verlichting volume, TIRF ideaal wanneer de PPI's vinden plaats op de celmembraan. Bovendien transiënte transfecties leiden vaak tot hoge niveaus van eiwitexpressie, ver boven die van de endogene eiwitten die artefacten in het detecteren van de PPI kan veroorzaken. Daarom wordt aanbevolen dat stabiele cellijnen worden vastgesteld na een passende BiFC configuratie is vastgesteld door de eerste testen. Stabiele cellijnen hebben ook het potentieel voor afstembare expressie via doxycycline inductie ^15.

Na infectie worden cellen geselecteerd met antibiotica, meestal puromycine en neomycine, één voor elk construct. De volgende stappen voor de monstervoorbereiding, beeldacquisitie en data-analyse wordt in detail beschreven in de protocollen.

Bij deze benadering worden de vorming van clusters op nanoschaal BiFC-PALM beelden van Ras-Raf RBD routinematig waargenomen (Figuur 2A </ strong>). Consequent, SMT-PALM trajecten van Ras-Raf RBD vertonen een heterogene verdeling in de diffusie staten (figuur 2B-D). Deze resultaten suggereren dat Ras-Raf-complexen bestaan ​​meerdere toestanden op het celmembraan, vermoedelijk als monomeren en clusters, met potentiële biologische implicaties. Dit werk demonstreert de kracht van BiFC-PALM selectieve beeldvorming van protonpompremmers in cellen met nanometer ruimtelijke resolutie en gevoeligheid single molecule, die moeilijk te verkrijgen met gebruikelijke BiFC fluorescentie co-lokalisatie of fluorescentie-energieoverdracht (FRET) zijn.

Bij het ontwerpen van BiFC experimenten en interpretatie van de resultaten, is het belangrijk in het achterhoofd dat de BiFC proces onomkeerbaar is in de meeste gevallen, waaronder split PAmCherry1 te houden. Wanneer de twee fragmenten samen en vormen een volledige PAmCherry1 eiwit, de koppeling tussen de twee fragmenten, en daarmee de PPI permanent wordt. Dit beperkt het gebruik van BiFC en BiFC-PALM toezicht op de dynamiek van de protonpompremmers (bijv bindingskinetiek en niet de diffusie dynamiek van het eiwit complex eenmaal is gevormd) en soms zelfs kan leiden tot mislocalisatie van de PPI complexen.

Een bijkomende factor om te overwegen bij het ontwerpen BiFC PALM-experimenten is de vertraging in rijpingsproces chromofoor die inherent is aan fluorescente proteïnen. Zodra twee eiwitten interageren en de FP fragmenten samenkomen, ze meestal te hervouwen in de orde van seconden (rust van 60 seconden voor EYFP ^3). Latere chromofoor rijping en fluorescerend signaal voort in de orde van minuten. Terwijl de fluorescentie detecteerbaar kan zijn binnen 10 minuten na oplossen van split-Venus, een snel vouwen YFP-variant, de half-time voor de rijping in het algemeen vaak rond 60 min ^16. Split-PAmCherry1 werd waargenomen op vergelijkbare tarieven. Vandaar BiFC en BiFC-PALM zijn slechte keuzes voor het monitoren van real-time PPI kinetiek; andere methods, zoals FRET en een recent ontwikkelde afhankelijke dimerisatie fluorescent eiwit ^17, kunnen meer geschikt voor dit doel.

Protocol

1. Klonen Bepaal de configuraties te klonen en kies een linker. Tag-eiwitten met de fragmenten op het N- of C-terminus zoals hieronder beschreven zodat ze niet de juiste lokalisatie verstoren. Gebruik een flexibele linker, zoals (GGGGS) x2. Genetisch tag de eiwitten van belang aan de PAmCherry1 fragmenten. Als een optie, gebruik maken van de klonen in de materialen lijst met de fragmenten RN (PAmCherry1 residuen 1-159) en RC (Met plus PAmCherry1 resten 160-236) met flankerende MCS sequenties vermeld…

Representative Results

De BiFC-PALM getoonde voorbeeld is Kras G12D mutant interactie met de Ras-bindend domein (RBD) van craf (Figuur 1A). Zoals besproken werden de RN of RC fragmenten niet gelabeld aan de C-terminus van Ras omdat de membraanlokalisatie en dus de biologische activiteit van Ras zou verstoren. Dit verminderde de mogelijke combinaties 8-4 (Figuur 1B). Elk van deze vier combinaties werd ingebracht in cellen met behulp U2OS lentivirale infectie. De cellen werden vastgesteld zoals beschreven in he…

Discussion

BiFC is een veelgebruikte techniek voor het opsporen en visualiseren van PPI in cellen geweest, terwijl PALM is een recente single molecule superresolutiemicroscopie techniek die nanoschaal beeldvorming van intacte biologische monsters mogelijk maakt. De combinatie van BiFC met PALM bereikt selectieve beeldvorming van PPI's in een cel met nanometer ruimtelijke resolutie en single molecule gevoeligheid. BiFC-PALM breidt het nut van beide technieken, en zoals aangetoond in dit werk toont grote belofte in het openbaren…

Materials

TIRF Microscope	Nikon
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA	Nikon
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 897
561 nm laser	Coherent
405 nm laser	Coherent
561 nm dichroic mirror	Semrock	Di01-R405/488/561/635-25×36
561 nm filter	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter	Semrock	NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD Cloning	Clontech	639649
LR Clonase	Life Technologies	11791
Vira Power Lentivirus Packaging	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent	Roche	13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155409	#1.5 glass bottom dishes
U2OS cells	ATCC	HTB-96
293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
DMEM with phenol red	Life Technologies	11995
DMEM no phenol red	Life Technologies	21063
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082
Leibovit's L-15, no phenol red	Life Technologies	21083-027
Reduced serum medium	Life Technologies	31985
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14040
Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe filter	Millipore	SLHV033RB
Lentiviral concentrator	Clontech	631231
Retroviral concentrator	Clontech	631455
10 cm culture dish	BD Biosciences	353003
6-well culture plate	BD Biosciences	353046
Polybrene	Sigma	107689
Puromycin	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	Neomycin
Doxycyline	Fisher	BP2653
Tris base	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
Sodium Hydroxide	Sigma	S5881
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Glutaraldehyde	Sigma	G6257
PIPES	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Sodium chloride	Fisher	BP358
Magnesium chloride	Fisher	M33
100 nm gold particles	BBI Solutions	EM.GC100
Molecular grade water	Life Technologies	10977
Dpn1	New England Biolabs	R0176
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104
Midiprep kit	Macherey-Nagel	740410
0.6 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-120
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-137
15 mL tubes	Fisher	05-539-12
5 mL  polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352063
14 mL polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352059
50 mL tube	BD Biosciences	352070
PCR tube	GeneMate	C-3328-1
SOC medium	Life Technologies	15544
LB broth	BD Biosciences	244610
Kanamycin sulfate	Fisher	BP906
Competent cells	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks