Photoactivés Localisation Microscopie avec Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC-PALM)

Summary

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Abstract

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Introduction

Interactions protéine-protéine (IPP) sont fondamentales pour la biologie ^{1 et} sont strictement réglementés par des mécanismes spatio-temporelles dans de nombreuses échelles de temps et de longueur. Des études sur la signalisation sur la membrane cellulaire cellule, par exemple, ont mis en évidence des compartiments spatiales dynamiques, à l'échelle nanométrique qui facilitent IPP processus cellulaires spécifiques et ^2. Par conséquent, la capacité de sonder IPP dans les systèmes biologiques avec des résolutions suffisantes spatiales et temporelles, haute spécificité et une sensibilité élevée est essentielle pour parvenir à une compréhension des mécanismes de la biologie.

Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) est l'un des rares outils existants pour visualiser IPP dans une cellule avec une résolution subcellulaire et la compatibilité des cellules vivantes ^{3 ​​- 5.} La technique est relativement simple et implique le fractionnement d'une protéine de fluorescence en deux fragments non fluorescents; lorsque génétiquement marqués à deux protéines interagissant etamené à proximité, les fragments peuvent reconstituer pour former une protéine fluorescente complet, ce qui donne le signal fluorescent. Lorsqu'il est correctement conçu, sondes BiFC ne devraient pas reconstituer spontanément en l'absence des IPP. En tant que tel, le signal de fluorescence dans un essai BiFC ne se posera que dans la présence d'IPP, ce qui permet la visualisation directe des IPP avec une spécificité élevée. Les avantages supplémentaires de l'utilisation de la fluorescence que la lecture sont une haute sensibilité, une résolution subcellulaire, et la compatibilité avec un débit élevé et contenu dosages élevés de dépistage, entre autres. Pour ces avantages, un certain nombre de sondes BiFC basés sur différentes protéines fluorescentes parent ont été développés. Comme dans toutes les autres techniques de détection basées sur la microscopie optique classique, cependant, la résolution spatiale est limitée à BiFC ~ 250 nm par la diffraction de la lumière. Cela en fait un défi pour étudier la régulation des IPP à l'échelle nanométrique, qui, comme évoqué plus haut et illustré par des radeaux lipidiques ⁶ unee nanoclusters Ras ^7, est une échelle de longueur essentielle à la compréhension de nombreux processus cellulaires tels que la signalisation.

BiFC a été combinée avec Microscopie Palm (PALM) ^{8,9 à} surmonter cette limite de résolution spatiale pour former une image ¹⁰ IPP. PALM est une technique de microscopie à hyper-résolution récente qui contourne la limite de diffraction dans l'imagerie de fluorescence par l'activation et la localisation stochastique subdiffractive de molécules fluorescentes simples. Dans chaque cycle d'activation, une molécule fluorescente émet de quelques centaines à quelques milliers de photons et donnent lieu à une seule image molécule sur le détecteur. Bien que cette image est limité par diffraction (~ 250 nm de large), son centre de gravité peut être déterminée avec une précision beaucoup plus élevée, typiquement de l'ordre de 10 à 50 nm en fonction du nombre de photons détectés. En activant et la localisation de chaque molécule fluorescente dans l'échantillon, une image haute résolution peut être reconstruit. Performed sur les cellules vivantes, seule molécule de suivi (SMT) PALM permet en outre l'acquisition de milliers de trajectoires de diffusion de la protéine d'une cellule unique ^11. Surtout, PALM utilise des sondes fluorescentes spécialisées telles que les protéines fluorescentes photoactivables (PA-MF) pour obtenir l'activation stochastique. Depuis deux BiFC et des protéines fluorescentes utilisation PALM, ils ont été combinés en fractionnant PAmCherry1, un PA-FP couramment utilisé pour PALM, en deux fragments entre les acides aminés 159 et 160.

Le système basé sur PAmCherry1 BiFC partagé affiche faible signal de fond à partir de la reconstitution spontanée des deux fragments. Lorsque génétiquement marqués à une paire de protéines en interaction, les deux fragments (RN = 1 à 159 résidus de distillation; RC = Met + résidus 160-236) reconstitué de manière efficace pour former des protéines complètes PAmCherry1 même à 37 ° C et sans incubation à des températures plus basses, ce qui est pas le cas pour d'autres paires BiFC ¹² comme le parent mCherry ^13. Furthermore, la protéine de PAmCherry1 reconstitué conservé les propriétés photophysiques du PAmCherry1 mère, comme rapport de contraste élevé, rendement photonique moyen et photoactivation rapide, entre autres, qui sont essentiels pour la précision de localisation de la molécule unique et PALM imagerie à haute résolution.

Dans ce protocole, l'utilisation de BiFC-PALM pour imager interactions Ras-Raf dans des cellules en utilisant U2OS scission PAmCherry1 (figure 1A) est décrite. La première étape consiste à concevoir des constructions pour l'expression de protéines de fusion entre des fragments PAmCherry1 (c.-à-RN et RC) et les protéines d'intérêt. En théorie, pour chaque paire de protéines candidates (A et B), il y a huit paires de protéines de fusion à tester: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; et A-RC / B-RN. Ce processus peut souvent être simplifié en prenant en compte les propriétés structurales ou biochimiques des protéines candidates. Dans le cas de Ras, la protéine estmodifiée après traduction à la boîte CAAX C-terminal (C = Cys; A = aliphatique; X = y en a), après quoi le motif de AAX est clivé. Par conséquent, RN ou RC ne peuvent être fusionnés à l'extrémité N-terminale de Ras; ce qui réduit le nombre de paires de protéines de fusion à quatre (figure 1B). Pour Raf, le domaine Ras-contraignant (RBD; résidus 51-131) sont utilisées et peuvent être étiquetés à chaque extrémité. Ces quatre configurations de fusion ont été générés: RN-KRAS / RC-Raf RBD; RN-KRAS / Raf-RBD RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; et RC-KRAS / Raf RBD-RN.

En outre, l'agent de liaison entre les fragments et les protéines d'intérêt devra prendre en compte. Un lieur flexible d'environ dix acides aminés est souvent utilisé car il offre une liberté suffisante pour la complémentation de se produire. Une telle liaison est (GGGGS) x2, mais il ya beaucoup d'autres qui ont été appliquées avec succès, y compris des séquences aléatoires générées à partir d'un site de clonage multiple (MCS) ^14. La longueur des segments de liaison peut avoir besoin d'être optimisé depending sur la taille des protéines d'intérêt et leurs orientations lors de l'interaction.

Les fragments de PAmCherry1 sont contenues dans une petite épine dorsale de clonage avec accompagnement PMM (voir liste des matières). Les gènes d'intérêt peut être inséré via les sites de restriction ou avec un procédé de ligature indépendante. Après vérification de la séquence et le clonage, la cassette d'expression est transféré dans un vecteur d'expression en utilisant une réaction de recombinase, un procédé de clonage avec une grande fidélité et une grande efficacité.

Ensuite, les constructions d'expression résultants sont transfectés dans la lignée cellulaire cible ou, si une lignée cellulaire stable est souhaitée, conditionné dans des lentivirus pour infecter la lignée cellulaire cible. Transfection transitoire permet de valider rapidement les configurations BiFC, mais les problèmes potentiels doit être noté. Transfection en utilisant des produits chimiques souvent souligne les cellules, entraînant une forte auto-fluorescence; tandis que l'utilisation totale de la fluorescence à réflexion interne (FRBR) microscopy peut atténuer ce signal de fond en limitant le volume de l'éclairage, la FRBR idéal lorsque les IPP ont lieu sur la membrane cellulaire. En outre, des transfections transitoires conduisent souvent à des niveaux élevés d'expression de protéines, dépassant de loin celles des protéines endogènes, qui peuvent causer des artefacts à détecter les IPP. Par conséquent, il est recommandé que les lignées cellulaires stables sont établies après une configuration BiFC appropriée a été déterminée par l'essai initial. Des lignées cellulaires stables ont également le potentiel pour l'expression accordable par induction ¹⁵ doxycycline.

Après l'infection, les cellules sont sélectionnées avec des antibiotiques, typiquement la puromycine et à la néomycine, une pour chaque construction. Les étapes suivantes de préparation de l'échantillon, l'acquisition de l'image, et l'analyse des données vont être décrits en détail dans les protocoles.

Avec cette approche, la formation de grappes à l'échelle nanométrique en images BiFC-paume de Ras-Raf RBD sont régulièrement observé (figure 2A </ strong>). Constamment, les trajectoires SMT-paume de Ras-Raf RBD montrent une distribution hétérogène dans les Etats de diffusion (figure 2B-D). Ces résultats suggèrent que les complexes de Ras-Raf existent dans de multiples états sur la membrane cellulaire, probablement en tant que monomères et des grappes, avec des conséquences biologiques potentiels. Ce travail démontre la puissance de BiFC-PALM en imagerie sélective des IPP dans les cellules avec une résolution spatiale de nanomètre et sensibilité unique molécule, ce qui serait difficile à obtenir avec BiFC conventionnelle, la fluorescence co-localisation, ou le transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET).

Lors de la conception des expériences BiFC et interpréter les résultats, il est important de garder à l'esprit que le processus est irréversible BiFC dans la plupart des cas, y compris PAmCherry1 scission. Une fois que les deux fragments se combinent et forment une protéine de PAmCherry1 complet, la liaison entre les deux fragments, et donc l'IPP devient permanente. Ceci limite l'utilisation de BiFC et BiFC-PALM pour la surveillance de la dynamique des IPP (c.-à-cinétique de liaison et pas la dynamique de diffusion du complexe protéique fois qu'il est formé) et parfois pourrait même conduire à une mauvaise localisation des complexes de PPI.

Un autre facteur à considérer lors de la conception des expériences BiFC-Palm est le retard dans la maturation chromophore qui est inhérente à des protéines fluorescentes. Une fois que deux protéines interagissent et les fragments de PF se réunissent, ils replient généralement de l'ordre de secondes (à mi-temps de 60 sec pour EYFP ^3). Toutefois, après maturation chromophore fluorescent et se développent sur le signal de l'ordre de minutes. Alors que la fluorescence peut être détectable dans les 10 min après reconstitution du split-Vénus, une variante rapide pliage YFP, la mi-temps pour la maturation en général est souvent autour de 60 min ^16. Split-PAmCherry1 a été observé que des taux similaires. Par conséquent, BiFC et BiFC-PALM sont des choix actuellement pauvres pour le suivi cinétique de PPI en temps réel; autre methodes, comme FRET et une dimérisation récemment développé la protéine fluorescente dépendante ^17, peut être plus adapté à cet effet.

Protocol

1. Clonage Déterminer les configurations à cloner et à choisir un lieur. Protéines de Tag avec les fragments sur le N- ou C-terminale comme décrit ci-dessous afin qu'ils ne perturbent pas leur localisation correcte. Utilisez un lieur flexible tels que (GGGGS) x2. Marquer génétiquement les protéines d'intérêt aux fragments de PAmCherry1. Comme une option, utiliser les plasmides de clonage énumérés dans la liste des matériaux contenant les fragments RN (résidus de PAmCherry1 1-1…

Representative Results

L'exemple BiFC-PALM est montré KRAS mutant G12D interagir avec les Ras domaine de liaison (RBD) du CRAF (figure 1A). Comme on le verra, le RN ou fragments sont marqués RC à l'extrémité C-terminale de Ras, car il perturberait la localisation membranaire et donc l'activité biologique de Ras. Cela réduit les combinaisons possibles de huit à quatre (figure 1B). Chacune de ces quatre combinaisons a été introduit dans des cellules en utilisant U2OS infection lentivirale….

Discussion

BiFC est une technique couramment utilisée pour détecter et visualiser les cellules dans les IPP, alors que PALM est une technique de microscopie récent seule molécule à hyper-résolution nanométrique qui permet l'imagerie d'échantillons biologiques intacts. La combinaison de BiFC avec PALM atteint imagerie sélective des IPP dans une cellule avec une résolution spatiale de nanomètre et sensibilité unique molécule. BiFC-PALM étend l'utilité de ces deux techniques, et comme l'a démontré dan…

Materials

TIRF Microscope	Nikon
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA	Nikon
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 897
561 nm laser	Coherent
405 nm laser	Coherent
561 nm dichroic mirror	Semrock	Di01-R405/488/561/635-25×36
561 nm filter	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter	Semrock	NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD Cloning	Clontech	639649
LR Clonase	Life Technologies	11791
Vira Power Lentivirus Packaging	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent	Roche	13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155409	#1.5 glass bottom dishes
U2OS cells	ATCC	HTB-96
293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
DMEM with phenol red	Life Technologies	11995
DMEM no phenol red	Life Technologies	21063
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082
Leibovit's L-15, no phenol red	Life Technologies	21083-027
Reduced serum medium	Life Technologies	31985
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14040
Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe filter	Millipore	SLHV033RB
Lentiviral concentrator	Clontech	631231
Retroviral concentrator	Clontech	631455
10 cm culture dish	BD Biosciences	353003
6-well culture plate	BD Biosciences	353046
Polybrene	Sigma	107689
Puromycin	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	Neomycin
Doxycyline	Fisher	BP2653
Tris base	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
Sodium Hydroxide	Sigma	S5881
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Glutaraldehyde	Sigma	G6257
PIPES	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Sodium chloride	Fisher	BP358
Magnesium chloride	Fisher	M33
100 nm gold particles	BBI Solutions	EM.GC100
Molecular grade water	Life Technologies	10977
Dpn1	New England Biolabs	R0176
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104
Midiprep kit	Macherey-Nagel	740410
0.6 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-120
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-137
15 mL tubes	Fisher	05-539-12
5 mL  polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352063
14 mL polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352059
50 mL tube	BD Biosciences	352070
PCR tube	GeneMate	C-3328-1
SOC medium	Life Technologies	15544
LB broth	BD Biosciences	244610
Kanamycin sulfate	Fisher	BP906
Competent cells	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks