Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM)

Summary

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Abstract

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Introduction

Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) sind grundlegende Biologie ^{1 und} dicht über Raum-Zeit-Mechanismen über viele Zeit- und Längenskalen geregelt. Untersuchungen an Zellsignal auf der Zellmembran beispielsweise mit dynamischen nanoskaliger Orts Kompartimente spezifischen PPI und zelluläre Prozesse ^{2 zu erleichtern} enthüllt. Daher ist die Fähigkeit, die PPI in biologischen Systemen mit ausreichender räumlicher und zeitlicher Auflösung, hohe Spezifität und eine hohe Empfindlichkeit Sonde Schlüssel zu einem mechanistischen Verständnis der Biologie.

Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC) ist einer der wenigen vorhandenen Werkzeugen zur Visualisierung von PPI in einer Zelle mit subzellulärer Auflösung und Live-Zellverträglichkeit ^3-5. Die Technik ist relativ einfach und erfordert Aufspaltung eines fluoreszierenden Proteins in zwei nicht-fluoreszierenden Fragmente; wenn genetisch mit zwei interagierende Proteine ​​markiert undin die Nähe gebracht wird, können die Fragmente zu rekonstituieren, um eine vollständige fluoreszierende Protein zu bilden, wodurch Fluoreszenzsignal. Wenn sie richtig entworfen, sollte BIFC Sonden nicht spontan Rekonstitution in Abwesenheit von PPI. Als solches wird das Fluoreszenz-Signal in einem BiFC Assay nur in Gegenwart von PPI, der die direkte Visualisierung von EPI mit hoher Spezifität ermöglicht auftreten. Zusätzliche Vorteile der Verwendung von Fluoreszenz als Auslese sind hohe Empfindlichkeit, subzelluläre Auflösung, und die Kompatibilität mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt Screening-Assays, unter anderem. Für diesen Vorteilen eine Reihe von BiFC Sonden basierend auf unterschiedlichen Mutter fluoreszierenden Proteinen entwickelt worden. Wie in allen anderen Detektionsverfahren auf der Basis konventioneller Lichtmikroskopie ist jedoch die räumliche Auflösung der BiFC auf ~ 250 nm durch die Beugung des Lichts begrenzt. Dies macht es eine Herausforderung für die Regulierung der PPI im Nanobereich, die, wie bereits angedeutet und durch Lipid Rafts ⁶ eine beispielhaft zu studierennd Ras Nanocluster ^7, ist eine kritische Längenskala für das Verständnis vieler zellulärer Prozesse wie Signalisierung.

BIFC mit photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie ^(PALM) 8,9 kombiniert, um diese Grenze der räumlichen Auflösung für die Abbildung PPI ¹⁰ zu überwinden. PALM ist eine neue Superresolution Mikroskopie-Technik, die die Beugungsgrenze in der Fluoreszenzbildgebung durch stochastische Aktivierung und subdiffractive Lokalisierung der einzelnen fluoreszierenden Molekülen umgeht. In jedem Aktivierungszyklus emittiert ein fluoreszierendes Molekül zu einigen tausend Photonen einige hundert und führt zu einem einzigen Molekül Bild auf dem Detektor. Während das Bild beugungsbegrenzt (~ 250 nm in der Breite), dessen Schwerpunkt mit einer wesentlich höheren Genauigkeit typischerweise in der Größenordnung von 10-50 nm in Abhängigkeit von der Anzahl der detektierten Photonen bestimmt werden. Durch Aktivieren und Lokalisieren jedes Fluoreszenzmolekül in der Probe kann eine hohe Bildauflösung zu rekonstruieren. Performed auf lebende Zellen, einzelnes Molekül Verfolgung (SMT-) PALM gestattet weiterhin Erwerb der Tausende von Proteindiffusionsbahnen von einer einzelnen Zelle ^11. Wichtig ist, verwendet PALM Fachfluoreszenzsonden wie photoaktivierbare fluoreszierende Proteine ​​(PA-RP), um stochastische Aktivierung zu erreichen. Da sowohl BIFC und PALM Verwendung fluoreszierender Proteine, werden sie durch die Spaltung von PAmCherry1, eine häufig verwendete PA-FP für PALM, in zwei Fragmente zwischen den Aminosäuren 159 und 160 zusammengefasst wurden.

Die BIFC System auf Basis von Split PAmCherry1 zeigt geringe Hintergrundsignal von spontanen Wiederherstellung der beiden Fragmente. Bei genetisch an ein Paar von interagierenden Proteinen markiert, die beiden Fragmente (RN = Reste 1-159; RC = Met + Reste 160-236) effizient rekonstituiert, um eine vollständige PAmCherry1 Proteine ​​auch bei 37 ° C und ohne Inkubation bei niedrigeren Temperaturen zu bilden, die nicht der Fall für andere BiFC ^Paare 12 wie der Mutter mCherry ^13. Furthermore, die rekonstituierte PAmCherry1 Protein behielt die photophysikalischen Eigenschaften der Mutter PAmCherry1 wie hohes Kontrastverhältnis, mittlere Photonenausbeute, und schnelle Photoaktivierung, unter anderem, die entscheidend für eine genaue Einzelmolekül-Lokalisierung und hochauflösende Bildgebung PALM sind.

In diesem Protokoll die Verwendung BiFC-PALM zum Abbilden Ras-Raf-Interaktionen in U2OS-Zellen unter Verwendung von geteilten PAmCherry1 (1A) beschrieben wird. Der erste Schritt besteht darin, die Konstrukte für die Expression von Fusionsproteinen zwischen PAmCherry1 Fragmente (dh, RN, RC) und die Proteine ​​von Interesse zu entwerfen. Theoretisch für jedes Paar von Kandidatenproteinen (A und B) gibt es acht Paare von Fusionsproteinen getestet: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; und A-RC / B-RN. Dieser Prozess kann oft unter Berücksichtigung der strukturellen oder biochemischen Eigenschaften der Kandidatenproteine ​​vereinfacht werden. Im Fall der Ras ist das Proteinpost-translational an dem C-terminal modifizierten CAAX-Box (C = Cys ist, A = aliphatische, X = beliebiger), wonach der AAX-Motiv abgespalten. Daher RN oder RC kann nur an den N-Terminus von Ras kondensiert sein kann; Dies reduziert die Anzahl der Fusionsprotein-Paare zu vier (1B). Für Raf, die Ras-Bindungsdomäne (RBD; Reste 51-131) verwendet und kann an beiden Enden versehen werden. Diese vier Fusionskonfigurationen generiert: RN-KRAS / RC-Raf RBD; RN-KRAS / Raf-RBD RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; und RC-KRAS / Raf RBD-RN.

Zusätzlich wird der Linker zwischen den Fragmenten und den interessierenden Proteine ​​zu berücksichtigen. Ein flexibler Linker von etwa zehn Aminosäuren wird häufig verwendet, da es eine ausreichende Freiheit für die Komplementierung auftreten. Einen solchen Linker (GGGGS) x2, obwohl es viele andere, die erfolgreich eingesetzt worden sind, einschließlich der Zufallsfolgen von einer multiplen Klonierungsstelle (MCS) ¹⁴ erzeugt wird. Die Länge der Linker können müssen dependin optimiertg von der Grße der interessierenden Proteine ​​und ihre Orientierungen bei der Interaktion.

Die PAmCherry1 Fragmente werden in einem kleinen Klonen Backbone mit flankierenden MCSs enthalten (siehe Materialliste). Gene von Interesse kann über die Restriktionsschnittstellen oder einem ligationsunabhängiges Verfahren eingefügt werden. Nach der Klonierung und Sequenzüberprüfung wird die Expressionskassette ein Expressionsvektor unter Verwendung eines Rekombinase-Reaktion, ein Klonierungsverfahren mit hoher Genauigkeit und hoher Effizienz übertragen.

Als nächstes wurden die resultierenden Expressionskonstrukte werden in das Zielzelllinie oder zur Infektion der Zielzelle transfiziert, wenn eine stabile Zelllinie zu erzeugen, in Lentivirus verpackt. Transiente Transfektion ermöglicht eine schnelle Validierung der BIFC Konfigurationen, aber mögliche Probleme zu beachten. Transfektion unter Verwendung von Chemikalien oft betont, die Zellen, was zu hohen Eigenfluoreszenz; während die Verwendung von interner Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) microscopy können dieses Hintergrundsignal zu mildern durch Begrenzung der Beleuchtungsvolumen, TIRF ideal, wenn die PPI auf der Zellmembran statt. Zusätzlich transienten Transfektionen führen oft zu hohe Proteinexpressionsniveaus, die weit über denen der endogene Proteine, die Artefakte bei der Erfassung der PPIs verursachen können. Daher ist es empfehlenswert, dass stabile Zelllinien etabliert, nachdem ein geeigneter BiFC Konfiguration hat erste Test wurde bestimmt. Stabile Zelllinien haben auch das Potenzial für durchstimmbare Expression über Doxycyclin Induktions ^15.

Nach der Infektion werden die Zellen mit Antibiotika ausgewählt, typischerweise Puromycin und Neomycin, eine für jedes Konstrukt. Die nachfolgenden Schritte für die Probenvorbereitung, Bildaufnahme und Datenanalyse wird im Detail in den Protokollen beschrieben.

Mit diesem Ansatz werden die Bildung von Nanoclustern in BiFC-Handabdrücken von Ras-Raf RBD routinemßig beobachtet (2A </ strong>). Konsequent, smt-PALM Flugbahnen von Ras-Raf-RBD zeigen eine heterogene Verteilung der Diffusionszustände (2B-D). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ras-Raf-Komplexe existieren in mehreren Staaten an der Zellmembran, vermutlich als Monomere und Clustern, mit möglichen biologischen Auswirkungen. Diese Arbeit zeigt die Macht der BIFC-PALM in selektiven Abbildung von PPI in Zellen mit Nanometer-Ortsauflösung und Einzelmolekül-Empfindlichkeit, die nur schwer mit herkömmlichen BIFC, Fluoreszenz-Co-Lokalisation, oder Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) erhalten würde.

Bei der Gestaltung BIFC Experimente und der Interpretation der Ergebnisse ist es wichtig zu beachten, dass die BIFC Vorgang ist irreversibel in den meisten Fällen, einschließlich Split PAmCherry1 halten. Sobald die beiden Fragmente kombiniert und bilden eine komplette PAmCherry1 Protein, die Bindung zwischen den beiden Fragmenten und damit die PPI permanent wird. Dies schränkt die Verwendung von BIFC und BIFC-PALM für die Überwachung der Dynamik der PPI (dh Bindungskinetik und nicht die Diffusion Dynamik des Proteinkomplexes, sobald sie gebildet ist) und manchmal sogar zu Fehllokalisation der PPI-Komplexe führen.

Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor bei der Gestaltung BIFC-PALM-Experimente ist die Verzögerung bei der Chromophor Reifung, die innewohnende fluoreszierende Proteine ​​ist. Einmal zwei Proteine ​​interagieren, und die FP-Fragmenten zusammenkommen, werden sie rückfalten typischerweise in der Größenordnung von Sekunden (Halbwertszeit von 60 sec für EYFP ^3). , Anschließende Chromophor Reifung und Fluoreszenzsignal zu entwickeln jedoch in der Größenordnung von Minuten. Während Fluoreszenz nachweisbar innerhalb von 10 Minuten nach Rekonstitution des Split-Venus, einer schnell Falten YFP-Variante zu sein, ist die Halbwertszeit für die Reifung im Allgemeinen oft rund 60 min ^16. Split-PAmCherry1 beobachtet ähnliche Preise haben. Daher BIFC und BIFC-PALM liegen noch schlechte Wahl für die Überwachung der Echtzeit-PPI-Kinetik; andere michthoden wie FRET und einem kürzlich entwickelten Dimerisierung abhängigen Fluoreszenzprotein ^{17 kann} mehr für diesen Zweck geeignet sein.

Protocol

1. Klonierung Bestimmen Sie die Konfigurationen zu klonen, und wählen Sie einen Linker. Tag-Proteine ​​mit den Fragmenten auf der N- oder C-Terminus, wie unten beschrieben, so dass sie ihre eigentliche Lokalisation zu stören. Verwenden Sie einen flexiblen Linker, wie beispielsweise (GGGGS) x2. Genetisch markieren die Proteine ​​von Interesse für die PAmCherry1 Fragmente. Als eine Option, verwenden Sie die in der Materialliste, die die Fragmente RN (PAmCherry1 Reste 1-159) und RC (Met zzgl…

Representative Results

Das gezeigte BIFC-PALM Beispiel ist KRAS-mutierten G12D Interaktion mit den Ras-Bindungsdomäne (RBD) von Craf (Abbildung 1A). Wie diskutiert, wurden die RN oder RC-Fragmente nicht an den C-Terminus von Ras markiert, weil es die Membranlokalisierung und daher die biologische Aktivität von Ras unterbrechen. Dies reduziert die möglichen Kombinationen von acht auf vier (1B). Jede dieser vier Kombinationen wurde in U2OS-Zellen unter Verwendung von lentiviralen Infektion eingeführt. Die Z…

Discussion

BiFC hat eine allgemein verwendete Technik zur Erfassung und Visualisierung PPIs in Zellen, während PALM ist ein neues einzelnes Molekül Auflösungs Mikroskopietechnik, die nanoskalige Abbildungs ​​intakter biologischer Proben ermöglicht. Die Kombination von BIFC mit PALM erreicht selektiven Abbildung von PPI in einer Zelle mit Nanometer-Ortsauflösung und Einzelmolekülempfindlichkeit. BIFC-PALM erweitert den Nutzen der beiden Techniken, und wie in dieser Arbeit gezeigt, ist äußerst viel versprechend bei der A…

Materials

TIRF Microscope	Nikon
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA	Nikon
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 897
561 nm laser	Coherent
405 nm laser	Coherent
561 nm dichroic mirror	Semrock	Di01-R405/488/561/635-25×36
561 nm filter	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter	Semrock	NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD Cloning	Clontech	639649
LR Clonase	Life Technologies	11791
Vira Power Lentivirus Packaging	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent	Roche	13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155409	#1.5 glass bottom dishes
U2OS cells	ATCC	HTB-96
293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
DMEM with phenol red	Life Technologies	11995
DMEM no phenol red	Life Technologies	21063
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082
Leibovit's L-15, no phenol red	Life Technologies	21083-027
Reduced serum medium	Life Technologies	31985
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14040
Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe filter	Millipore	SLHV033RB
Lentiviral concentrator	Clontech	631231
Retroviral concentrator	Clontech	631455
10 cm culture dish	BD Biosciences	353003
6-well culture plate	BD Biosciences	353046
Polybrene	Sigma	107689
Puromycin	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	Neomycin
Doxycyline	Fisher	BP2653
Tris base	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
Sodium Hydroxide	Sigma	S5881
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Glutaraldehyde	Sigma	G6257
PIPES	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Sodium chloride	Fisher	BP358
Magnesium chloride	Fisher	M33
100 nm gold particles	BBI Solutions	EM.GC100
Molecular grade water	Life Technologies	10977
Dpn1	New England Biolabs	R0176
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104
Midiprep kit	Macherey-Nagel	740410
0.6 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-120
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-137
15 mL tubes	Fisher	05-539-12
5 mL  polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352063
14 mL polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352059
50 mL tube	BD Biosciences	352070
PCR tube	GeneMate	C-3328-1
SOC medium	Life Technologies	15544
LB broth	BD Biosciences	244610
Kanamycin sulfate	Fisher	BP906
Competent cells	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks