Фотоактивированные Локализация микроскопия с Бимолекулярные флуоресценции комплементации (BiFC-PALM)
Summary
Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.
Abstract
Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.
Introduction
Белок-белковые взаимодействия (ИПП) являются основой для биологии 1 и жестко регулируется с помощью пространственно-временных механизмов по многим длины и времени масштабах. Исследования клеточной сигнализации на клеточной мембране, например, показали, динамические, наноразмерные пространственные отсеки, которые облегчают конкретных ИЦП и клеточные процессы 2. Следовательно, возможность проверки ИЦП в биологических системах с достаточным пространственным и временным разрешением, высокой специфичностью и высокой чувствительностью является ключом к достижению механическое понимание биологии.
Бимолекулярные флуоресценции комплементации (BiFC) является одним из немногих существующих инструментов для визуализации ИЦП в клетке с субклеточном разрешение и совместимости жить-клеток 3 – 5. Техника достаточно проста и включает в себя расщепление флуоресценции белка в двух нефлуоресцентных фрагментов; когда генетически привязаны к двух взаимодействующих белков иприведены в близости, фрагменты могут восстановить, чтобы сформировать полный флуоресцентный белок, с получением флуоресцентного сигнала. При правильном проектировании BiFC зонды не должны самопроизвольно восстановить в отсутствие ИПП. Таким образом, сигнал флуоресценции в анализе BiFC будет возникать только в присутствии ИПП, который позволяет прямой визуализации ИПП с высокой специфичностью. Дополнительные преимущества использования флуоресценции как отсчеты высокой чувствительностью, субклеточных разрешение, а также совместимость с высокой пропускной способностью и высоким содержанием скрининга, среди других. Для этих льгот, были разработаны ряд BiFC зондов, основанных на различных белков родитель люминесцентных. Как и во всех других методов обнаружения на основе обычной световой микроскопии, однако, пространственное разрешение BiFC ограничено ~ 250 нм с помощью дифракции света. Это делает его вызов изучить регулирование ИПП на наноуровне, который, как упоминал ранее, и на примере липидов плоты 6 Aй Ras нанокластеры 7, является критическим масштаб длины к пониманию многих клеточных процессов, таких как сигнализации.
BiFC была объединена с фотоактивируемой локализации микроскопии (PALM) 8,9 преодолеть этот предел в пространственного разрешения для визуализации ИЦП 10. PALM является новый метод микроскопии сверхразрешения, что обходит дифракционный предел в флуоресценции через стохастической активации и subdiffractive локализации отдельных флуоресцентных молекул. В каждом цикле активации, флуоресцентная молекула излучает нескольких сотен до нескольких тысяч фотонов и приводит к одной молекуле изображения на детекторе. В то время как изображение дифракционной (~ 250 нм в ширину), его центр тяжести может быть определена с гораздо более высокой точностью, как правило, порядка 10-50 нм в зависимости от числа фотонов, зарегистрированных. При активации и локализации каждый флуоресцентный молекулу в пробе, высокое разрешение изображения может быть восстановлена. Performeд на живые клетки, одна молекула отслеживания (СМТ) ПАЛМ дальнейшие разрешения приобретение тысяч диффузии белка траекторий из одной клетки 11. Важно отметить, что PALM использует специализированные флуоресцентных зондов, таких как фотоактивируемых флуоресцентных белков (ПА-FPS), чтобы достичь стохастический активации. Так как BiFC и PALM использование флуоресцентных белков, они были объединены путем разделения PAmCherry1, обычно используемый PA-FP для PALM, в двух фрагментов между аминокислотами 159 и 160.
Система основана на BiFC разделенного PAmCherry1 показывает низкий фоновый сигнал от спонтанных восстановление двух фрагментов. При генетически привязаны к паре взаимодействующих белков, два фрагмента (РН = остатки 1-159; RC = Met + остатки 160-236) восстанавливали эффективно формировать полные PAmCherry1 белки, даже при 37 ° С и без инкубации при более низких температурах, что это не так для других пар 12 BiFC, таких как родителя mCherry 13. FurthermoRe, восстановленный белок PAmCherry1 сохранил фотофизические свойства родительского PAmCherry1, такие как высокая контрастность, выход среднего фотона, и быстро фотоактивации, среди других, которые имеют решающее значение для точной локализации одной молекулы и PALM изображений с высоким разрешением.
В этом протоколе, использование BiFC пальма для визуализации Рас-Raf взаимодействий в клетках U2OS с помощью разделения PAmCherry1 (фиг.1А) описан. Первым шагом является разработка конструкции, для выражения слитые белки между PAmCherry1 фрагментов (т.е., RN и RC) и белков, представляющих интерес. В теории, для каждой пары кандидатов белков (А и В), существует восемь пар слитых белков, которые будут проверены: РН-А / RC-B; РН-A / B-RC; RC-А / РН-В; RC-A / B-РН; А-РН / RC-Б; А-РН / B-RC; А-RC / РН-В; и А-RC / B-РН. Этот процесс часто может быть упрощена с учетом структурных или биохимических свойств белков-кандидатов. В случае Ras, белокпосттрансляционно изменен на CAAX коробке С-концевой (C = Cys; А = алифатический, X = любое), после чего AAX мотив отщепляется. Следовательно, Р. или RC может быть слит только N-конца Ras; это снижает количество пар слитый белок четырех (фиг.1В). Для Raf, Рас-то связывающего домена (RBD; остатки 51-131) используется и может быть помечены на любом конце. Были получены эти четыре конфигурации слияния: РН-Крас / RC-Раф РосБР; РН-Крас / Раф РосБР-RC; RC-Крас / РН-Раф РосБР; и RC-Крас / Раф РосБР-РН.
Кроме того, линкер между фрагментами и представляющих интерес белков необходимо будет учитывать. Гибкий линкер около десяти аминокислот часто используется, поскольку он обеспечивает достаточную свободу для комплементации происходят. Одним из таких линкер (GGGGS) х2, хотя есть много других, которые были успешно применены, в том числе случайных последовательностей, генерируемых из множественного клонирования (MCS) 14. Длина линкеров может должны быть оптимизированы в зависимг от размера белков интерес и их ориентации при взаимодействии.
Фрагменты PAmCherry1 содержатся в небольшом клонирования позвоночника с фланговые MCSS (см список материалов). Гены интерес может быть вставлен с помощью сайтов рестрикции или лигирования с независимым методом. После клонирования и последовательности проверки, кассета экспрессии передается в вектор экспрессии с использованием реакции рекомбиназы, процесс клонирования с высокой точностью и высокой эффективностью.
Затем полученный экспрессирующие конструкции трансфицировали в клетки-мишени линии или, если стабильной клеточной линии желательно, упаковывают в лентивирусов для инфицирования линии клеток-мишеней. Временная трансфекция позволяет быстро проверки конфигураций BiFC, но потенциальные проблемы должны быть отмечены. Трансфекция с использованием химических веществ, часто подчеркивает клетки, что приводит к высокой флуоресценции; в то время как использование общей флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) microscoру может смягчить эту фоновый сигнал путем ограничения объема освещения, TIRF идеал, когда ИПП состоится на клеточной мембране. Кроме того, переходные трансфекции часто приводят к высоким уровням экспрессии белка, что значительно превышает те из эндогенных белков, которые могут привести к появлению артефактов в обнаружении ИЦП. Следовательно, рекомендуется, чтобы стабильных клеточных линий, будут созданы после соответствующей конфигурации BiFC была определена с помощью начального тестирования. Стабильные клеточные линии также имеют потенциал для перестраиваемого выражения с помощью доксициклина индукции 15.
После заражения, клетки отбирают с помощью антибиотиков, как правило, пуромицин и неомицин, по одному для каждой конструкции. Последующие шаги для подготовки образца, получения изображений и анализа данных будет подробно описан в протоколах.
При таком подходе, наблюдается формирование наноразмерных кластеров в BiFC-PALM изображений Рас-Raf РосБР регулярно (2А </ STRONG>). Последовательно, SMT-PALM траектории Рас-Raf РосБР показать неоднородность распределения в диффузионной государств (2В-D). Эти результаты показывают, что существуют Рас-Raf комплексов в нескольких штатах на клеточной мембране, по-видимому, как мономеры и кластеры, с потенциальными биологических последствий. Эта работа демонстрирует силу BiFC-PALM в избирательном изображений ИПП в клетках с нанометровым пространственным разрешением и чувствительностью одной молекулы, которая будет трудно получить с обычными BiFC, флуоресценции совместной локализации, или флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET).
При проектировании BiFC эксперименты и интерпретации результатов, важно иметь в виду, что процесс необратим BiFC в большинстве случаев, в том числе сплит PAmCherry1. После того, как два фрагмента объединить и образуют полную PAmCherry1 белок, связь между двумя фрагментами, и, таким образом PPI становится постоянным. Это ограничивает использование BiFC и BiFC-PALМ для мониторинга динамики ИЦП (т.е. обязательные кинетики и динамики не диффузии белкового комплекса, когда он формируется), а порой может даже привести к mislocalization ИЦП комплексов.
Дополнительным фактором, чтобы рассмотреть при проектировании BiFC пальма эксперименты задержка в созревании хромофора, что присуще флуоресцентных белков. После того, как два белка взаимодействуют и фрагменты FP собрались вместе, они, как правило повторно сворачивают порядка секунд (половина времени 60 сек для EYFP 3). Тем не менее, последующее созревание хромофора и флуоресцентный сигнал развивать порядка минут. В то время как флуоресценция может быть обнаружено в пределах 10 мин после восстановления сплит-Венеры, быстро складной YFP вариант, половина времени для созревания в целом часто около 60 мин 16. Сплит-PAmCherry1 наблюдалось, имеют аналогичные ставки. Следовательно, BiFC и BiFC пальма в настоящее время плохой выбор для мониторинга в режиме реального времени PPI кинетики; другой яthods, такие как FRET и недавно разработанный димеризации зависит флуоресцентного белка 17 может быть более подходящим для этой цели.
Protocol
Representative Results
Discussion
BiFC был обычно используемая техника для обнаружения и визуализации ИЦП в клетках, в то время как PALM является недавний сингл сверхразрешение молекула техника микроскопии, который позволяет нано изображений неповрежденных биологических образцов. Сочетание BiFC с PALM достигается избирател…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Drs. Steven Chu and Joe W. Gray for helpful discussions, Henry Marr for his initial work on the BiFC-PALM project, and Alexis Shoemaker for her technical assistance. This work is supported by startup funds to X.N. from OHSU. Research in the Nan laboratory was also supported by NIH 5U54CA143836-05, the Damon Runyon Cancer Research Foundation, the M. J. Murdock Charitable Trust, and the FEI company.
Materials
| TIRF Microscope | Nikon | ||
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | ||
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Coherent | ||
| 405 nm laser | Coherent | ||
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25×36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | |||
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 mL tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
References
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
- Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589 (2014).
- Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).
- Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
- Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Coligan, J. E. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Appendix 4, 4D (2001).
- Morrison, S. L., Coligan, J. E., et al. Preparing frozen bacterial stocks. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3, Appendix 3M (2001).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
- Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
- Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).
