Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für spezifische siRNA-vermittelten mRNA-Abbau, gefolgt von Immunfluoreszenz-Analyse, um meiotische Spindel-Anordnung und Organisation in der Maus-Oozyten zu bewerten. Dieses Protokoll ist für die in vitro-Abreicherung von Transkripten und funktionale Bewertung verschiedener Spindel und / oder MTOC-assoziierten Faktoren in Oocyten.
Abstract
Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down’s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.
Introduction
Die Meiose ist eine einzigartige Teilungsprozess, die in Keimzellen (Eizellen und Spermien) tritt auf, und umfasst zwei aufeinanderfolgende Divisionen ohne dazwischen DNA-Synthese auf homologen Chromosomen und Schwesterchromatiden während der Meiose-I und Meiose-II, die jeweils 1 zu trennen. Fehler in der Chromosomensegregation während der Meiose in Oocyten können in Aneuploidie, die durch den Embryo während der Befruchtung vererbt wird zur Folge haben. Bemerkenswert ist, das Auftreten von Aneuploidie in sich entwickelnden Embryonen erhöht mit zunehmendem Alter der Mutter und ist eine Hauptursache von angeborenen Missbildungen sowie Verlust der Schwangerschaft bei Frauen 1,2, so unterstreicht eine wichtige Notwendigkeit, die molekularen Grundlagen der Aneuploidie im Reifeteilung zu verstehen, .
Während der Zellteilung ist Chromosomensegregation entscheidend von der Montage des Mikrotubuli-Spindelapparat und Etablierung von stabilen Chromosomen-Mikrotubuli-Interaktionen auf korrekte Befestigung zu GegenspindelPole. Wichtiger ist, meiotischen Spindelbildung in Säuger Oozyten unterscheidet sich von Mitose in somatischen Zellen und durch einzigartige Mikrotubuli-Organisationszentren (MTOCs) die centrioles 3,4 fehlt geregelt. Essentiellen Proteine für Mikrotubulusbildung und Organisation notwendig zu lokalisieren, um Eizelle MTOCs, einschließlich γ-Tubulin, die Mikrotubuli Montage katalysiert. Zusätzlich Pericentrin Funktionen als wesentlichen Gerüstprotein, das bindet und Dübel γ-Tubulin, sowie andere Faktoren MTOCs 5. Insbesondere zeigen unsere Studien, daß Abreicherung Schlüssel MTOC-assoziierten Proteine stört meiotischen Spindel Organisation und führt zu Fehlern in der Chromosomensegregation Oozyten, die nicht vollständig durch die Spindelanordnung checkpoint (SAC) 6,7 gelöst sind. Daher Fehlern Spindel Stabilität, die Meiosehemmung nicht auslösen, ein erhebliches Risiko als Beitrag zu Aneuploidie. Trotz ihrer wesentliche Rolle bei der Spindelanordnung und Organisation, Eizelle MTOC protEin Zusammensetzung und Funktion bleibt kaum verstanden.
Testen der Funktion spezifischer Zielproteine in Säugetier Oozyten ist eine Herausforderung, da die Zellen transkriptionell Ruhe kurz vor der Wiederaufnahme der Meiose 8,9. Daher verlassen sich präovulatorischen Oozyten auf mütterliche mRNA speichert, um die Meiose wieder aufzunehmen und zu unterstützen Reifeteilung sowie die ersten Furchungsteilungen nach der Befruchtung 10,11. Die Wirksamkeit der RNA-Interferenz (RNAi) vermittelten Abbau der mRNA-Transkripte in Säuger Oozyten ist gut etabliert und Mütter RNAs für die Übersetzung während der meiotischen Reifung rekrutiert werden, um siRNA Targeting 12-14 besonders zugänglich. Daher stellt die Mikroinjektion von short interfering RNAs (siRNAs) in Oozyten einen wertvollen Ansatz für die Ziel-mRNAs für die Funktionsprüfung führen.
Hier werden Verfahren zur Isolierung von Maus-Oozyten und siRNA-vermittelte Abreicherung von spezifischen transcri beschreiben wirPunkte, die Funktion eines wesentlichen MTOC-assoziiertes Protein zu testen, Pericentrin. Darüber hinaus beschreiben wir Immunofluoreszenzanalyse Bedingungen meiotischen Spindelbildung in Oozyten zu bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zwar gibt es verschiedene Methoden zur exogene Nukleinsäure-Transfer in somatischen Zellen, wie Elektroporation und Transfektion die Mikroinjektion ist die beste Methode für die Lieferung von RNA-Molekülen in transkriptionell ruhenden Maus-Oozyten. Das aktuelle Protokoll stellt einen effektiven Ansatz für in vitro-Abreicherung von spezifischen mRNAs, die die Funktionstests der verschiedenen Spindel und / oder MTOC-assoziierten Faktoren in Oozyten zu aktivieren. Dieser Ansatz führt zu einer effizienten Tran…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.
Materials
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
References
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