SiRNA aracılı susturma Mouse Oositlerinin içinde mayoz Mili Değerlendirmesi
Summary
Burada, fare oosit mayoz mili montaj ve organizasyon değerlendirmek için immünoflüoresans analizi ile takip özgü siRNA aracılı mRNA tükenmesi için bir protokol mevcut. Bu protokol, transkript in vitro tükenmesi ve farklı mili ve / veya oositlerde MTOC ilişkili faktörler fonksiyonel değerlendirmesi için uygundur.
Abstract
Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down’s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.
Introduction
Mayoz gametlerin (oosit ve sperm) oluşur ve mayoz-I ve mayoz-II, sırasıyla 1 sırasında homolog kromozom ve kardeş kromatidler ayırmak için DNA sentezini müdahale olmadan iki ardışık bölümler içeren benzersiz bir bölünme sürecidir. Oositlerde öz değişmesine ait bölünme sırasında kromozomların dağılması hatalar fertilizasyon esnasında embriyo tarafından devralınır anoploidi, neden olabilir. Özellikle, gelişmekte olan embriyolarda anöploidi sıklığı anne yaşı ilerledikçe artar ve kadınlarda 1,2 gebelik kaybı yanı sıra konjenital doğum kusurları önemli bir nedenidir, bu nedenle, mayoz bölünme sırasında anöploidinin moleküler temelini anlamak için önemli bir ihtiyacı vurgulayan .
Hücre bölünmesi sırasında, kromozom ayrımı ters göbeğine doğru eki için mikrotübül mili aparatı ve istikrarlı kromozom-mikrotübül etkileşimlerin kurulması montajı ile ilgili hayati bağlıdırkutuplar. Önemli olarak, memeli oositlerinde öz değişmesine ait iğ formasyonu somatik hücrelerde mitoz farklıdır ve benzersiz mikrotübül organize merkezleri sentriyoller 3,4 eksikliği (MTOCs) tarafından düzenlenir. Mikrotübül çekirdeklenme ve organizasyon için gerekli esansiyel proteinler mikrotübül düzeneğini katalize γ-tubulin dahil oosit MTOCs, lokalize. Buna ek olarak, MTOCs 5 de bağlanan bir esas iskele proteini olarak işlev görür ve ankraj γ-tubulin gibi diğer faktörler pericentrin. Özellikle, çalışmalarımız önemli MTOC ilişkili proteinlerin tükenmesi mayoz iğ organizasyon bozar ve tam mili montaj kontrol noktasında (SAC) 6,7 tarafından çözüldü olmayan oosit kromozom ayrımı hataları neden olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, mayoz tutuklanmasını tetiklemez iğ istikrar kusurları, anöploidi katkıda önemli bir risk oluşturmaktadır. Mili montaj ve organizasyon, oosit MTOC prot önemli rolleri rağmenein kompozisyon ve fonksiyon pek iyi anlaşılamamıştır.
Hücreler kısa mayoz 8,9 yeniden başlaması öncesinde transkripsiyonel sakin olmak gibi memeli oositlerinde belirli hedef proteinlerin fonksiyonlarını test zordur. Bu nedenle, ön-ovulatuar oosit mayoz devam etmek için anne mRNA mağazaları güveniyor ve mayoz bölünme yanı sıra gübreleme 10,11 sonra ilk bölünme bölünmeleri destekler. Memeli oositlerinde mRNA transkriptlerinin RNA interferans (RNAi) aracılı degradasyon etkinliği iyi bilinmektedir ve mayoz olgunlaşma sırasında çeviri için işe anne RNA'lar siRNA 12-14 hedefleme için özellikle uygundurlar. Bu nedenle, oosit içine kısa müdahale RNA'lar mikroenjeksiyon (siRNA) fonksiyonel test için hedef mRNA'ları tüketmek için değerli bir yaklaşım sağlar.
Burada, fare oositleri ve spesifik Transcri siRNA aracılı tükenmesi izolasyonu için yöntemleri tarif ederPTS pericentrin temel bir MTOC ilişkili proteinin fonksiyonunu test etmek. Buna ek olarak, oositlerde öz değişmesine ait iğ formasyonunun değerlendirmek için immünofloresan analiz koşulları açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Örneğin elektroporasyon transfeksiyon ve somatik hücreler, ekzojen nükleik asit aktarımı için çok sayıda yöntem vardır birlikte, mikro-enjeksiyon, transkripsiyonel olarak hareketsiz bir fare oositlerine RNA moleküllerinin verilmesi için uygun bir yöntemdir. Mevcut protokol farklı mili ve / veya oositlerde MTOC ilişkili faktörler fonksiyonel test sağlayan spesifik mRNA in vitro tükenmesi için etkili bir yaklaşım sağlar. Bu yaklaşım, verimli transkript tükenmesi ile sonuçlanır ve son d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.
Materials
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes. J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).
- Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance. Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).
- Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes. Dev Biol. 339 (439-450), (2010).
- Ma, W., Viveiros, M. M. Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization. Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).
- Bouniol-Baly, C., et al. Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes. Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).
- De La Fuente, R., Eppig, J. J. Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling. Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).
- Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes. Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).
- De La Fuente, R. Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes. Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).
- Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).
- Svoboda, P. Renaissance of mammalian endogenous RNAi. FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).
