Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדלדול mRNA ספציפי בתיווך siRNA אחרי ניתוח immunofluorescence להעריך הרכבה ציר meiotic וארגון בביציות עכבר. פרוטוקול זה מתאים לדלדול במבחנה של תמלילים והערכה תפקודית של ציר שונה ו / או גורמים הקשורים MTOC בביציות.
Abstract
Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down’s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.
Introduction
מיוזה היא תהליך החלוקה ייחודי המתרחש בתאי מין (ביציות וזרע) וכולל שתי חטיבות רצופות ללא התערבות סינתזת DNA להפריד כרומוזומים הומולוגיים וchromatids האחות במהלך מיוזה-אני ומיוזה-השנייה, בהתאמה 1. שגיאות בהפרדת כרומוזום במהלך חלוקת meiotic בביציות יכולות לגרום aneuploidy, שעובר בירושה על ידי העובר במהלך הפריה. יש לציין, השכיחות של aneuploidy בעוברים מתפתחים עולה עם עלייה בגיל האם והיא אחד גורמים עיקריים למומים מולדים, כמו גם אובדן הריון בנשים 1,2, וכך, מדגיש את הצורך חשוב להבין את הבסיס המולקולרי של aneuploidy במהלך חלוקת meiotic .
במהלך חלוקת תא, הפרדה כרומוזום היא מכריע תלויה בהרכבה של מנגנון ציר microtubule והקמה של אינטראקציות כרומוזום-microtubule יציבה עבור התקשרות נכונה לציר הפוךקטבים. חשוב לציין, היווצרות ציר meiotic בביציות של יונקים שונים ממיטוזה בתאים סומטיים, ומוסדרת על ידי מרכזי ארגון-microtubule הייחודיים (MTOCs) שחסרי centrioles 3,4. חלבונים חיוניים נחוצים להתגרענות microtubule וארגון למקם לMTOCs ביצית, כולל γ טובולין שמזרז הרכבה microtubule. בנוסף, pericentrin פונקציות כמו חלבון פיגומים חיוני, אשר נקשר ועוגני γ טובולין, כמו גם גורמים אחרים בMTOCs 5. יש לציין, המחקרים שלנו מראים כי דלדול של חלבונים הקשורים-MTOC מפתח משבש ארגון ציר meiotic ומוביל לשגיאות הפרדת כרומוזום בביציות, שאינם מלא נפתרו על ידי מחסום ההרכבה ציר (SAC) 6,7. לכן, פגמים ביציבות ציר, שאינו מפעילים את מעצר meiotic, מהווים סיכון משמעותי בתרומה לaneuploidy. למרות התפקיד החיוני שלהם בהרכבת ציר וארגון, prot MTOC הביציתהרכב עין ותפקוד נשאר הבינו היטב.
בדיקת תפקודם של חלבוני יעד ספציפיים בביציות יונקים היא מאתגרת, כמו התאים להפוך לתעתיק שקטים זמן קצר לפני חידוש מיוזה 8,9. לפיכך, ביציות מראש ביוץ להסתמך על חנויות mRNA אימהיות לחדש מיוזה ותומכות בחלוקה meiotic כמו גם חטיבות המחשוף הראשונות לאחר ההפריה 10,11. היעילות של התערבות RNA השפלה (RNAi) בתיווך של תעתיקי mRNA בביציות יונקים היא מבוססת היטב וRNAs האימהי גויס לתרגום במהלך התבגרות meiotic במיוחד נוח לsiRNA מיקוד 12-14. לכן, microinjection של RNAs התערבות הקצר (siRNAs) לביציות מספק גישה רבת ערך לרוקן mRNAs היעד לבדיקה פונקציונלית.
כאן אנו מתארים שיטות לבידוד של ביציות עכבר ודלדול בתיווך siRNA של transcri הספציפינק 'כדי לבדוק את התפקוד של חלבון הקשורים MTOC חיוני, pericentrin. בנוסף, אנו מתארים תנאי ניתוח immunofluorescence להעריך היווצרות ציר meiotic בביציות.
Protocol
Representative Results
Discussion
אמנם יש מספר שיטות להעברת חומצות גרעין אקסוגניים לתאים סומטיים, כגון electroporation וtransfection, microinjection הוא השיטה האופטימלית עבור משלוח של מולקולות RNA לביציות עכבר תעתיק שקטות. הפרוטוקול הנוכחי מספק גישה יעילה לדלדול במבחנה של mRNAs הספציפי המאפשר בדיקה הפונקציונלית של צי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.
Materials
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes. J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).
- Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance. Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).
- Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes. Dev Biol. 339 (439-450), (2010).
- Ma, W., Viveiros, M. M. Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization. Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).
- Bouniol-Baly, C., et al. Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes. Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).
- De La Fuente, R., Eppig, J. J. Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling. Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).
- Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes. Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).
- De La Fuente, R. Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes. Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).
- Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).
- Svoboda, P. Renaissance of mammalian endogenous RNAi. FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).
