جيل المحددة والمسوخ Markerless في أنواع السيانوبكتيريا نموذج
Summary
Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.
Abstract
Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of ‘escape’ of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.
Introduction
البكتيريا الزرقاء هي أحد الأسرة في اللغات تطويريا القديمة ومتنوعة من البكتيريا الموجودة في البيئة الطبيعية تقريبا على الأرض. في النظم الإيكولوجية البحرية أنها وفيرة للغاية ولعب دورا رئيسيا في العديد من الدورات المواد الغذائية، وهو ما يمثل ما يقرب من نصف تثبيت الكربون 1، والغالبية العظمى من تثبيت النيتروجين 2 ومئات الملايين من الأطنان من إنتاج النفط والغاز 3 في المحيطات سنويا. البلاستيدات الخضراء، العضية المسؤولة عن عملية التمثيل الضوئي في الطحالب والنباتات حقيقية النواة، من المرجح أن تطورت من cyanobacterium الذي كان محاطا الكائن المضيف 4. وقد ثبت أن البكتيريا الزرقاء الكائنات نموذج مفيدة لدراسة التمثيل الضوئي، نقل الإلكترون 5 والمسارات البيوكيميائية، وكثير منها يتم حفظها في النباتات. وبالإضافة إلى ذلك البكتيريا الزرقاء تستخدم بشكل متزايد لإنتاج الغذاء والوقود الحيوي 6، 7 الكهرباء والصناعية مركبات 8، بسبب مرحبا بهمتحويل كفاءة ghly من الماء وثاني أكسيد الكربون 2 إلى الكتلة الحيوية باستخدام الطاقة الشمسية 9. العديد من الأنواع يمكن زراعتها في الأراضي غير الصالحة للزراعة مع الحد الأدنى من المواد الغذائية ومياه البحر، مما يوحي بأن البكتيريا الزرقاء يحتمل زراعتها في نطاق واسع دون أن يؤثر ذلك على الإنتاج الزراعي. بعض الأنواع هي أيضا مصادر للمنتجات الطبيعية، بما في ذلك فطريات، مضاد للجراثيم ومضاد للسرطان المركبات 10،11.
القدرة على توليد المسوخ هي المفتاح لفهم السيانوبكتيريا الضوئي، والكيمياء الحيوية وعلم وظائف الأعضاء، وضرورية لتطوير سلالات للأغراض الصناعية. معظم الدراسات التي نشرت توليد سلالات معدلة وراثيا عن طريق إدخال الكاسيت المقاومة للمضادات الحيوية في الموقع من الفائدة. وهذا يحد من عدد من الطفرات التي يمكن إدخالها إلى سلالة، كما ليست سوى عدد قليل من الأشرطة المقاومة للمضادات الحيوية المتاحة للاستخدام في البكتيريا الزرقاء. سلالات تحتوي على جينات تمنح إعادة المضادات الحيويةمقاومة لأ لا يمكن استخدامها للإنتاج الصناعي في البرك المفتوحة، والتي من المرجح أن تكون وسيلة فعالة من حيث التكلفة الوحيدة لإنتاج الوقود الحيوي وغيرها من المنتجات ذات القيمة المنخفضة 12. جيل من المسوخ تحمل علامات يتغلب على هذه القيود. المسوخ تحمل علامات لا تحتوي على الحمض النووي الأجنبية، إلا إذا تضمن عمدا، ويمكن التلاعب بها عدة مرات. ولذلك فمن الممكن توليد العديد من التعديلات في سلالة كما تريد. وبالإضافة إلى ذلك، والآثار القطبية على الجينات المصب للموقع تعديل يمكن أن يكون الحد الأدنى، مما يسمح التعديل أكثر دقة للكائن الحي (13).
لتوليد سلالات متحولة، البلازميدات الانتحارية التي تحتوي على اثنين شظايا الحمض النووي متطابقة إلى مناطق في الكروموسوم السيانوبكتيريا المرافقة الجين المراد حذفه (وهو ما يسمى 5 'و 3' المناطق المحيطة) هي التي شيدت أولا. ثم يتم إدراج اثنين من الجينات بين هذه المناطق المحيطة. واحدة من هذه يشفر بروتين المقاومة للمضادات الحيوية. ثاني بترميز هيئة تنسيق المعونة، التي همزuces ليفانسوكراز، وهو مركب يمنح الحساسية للالسكروز. في المرحلة الأولى من العملية، المسوخ ملحوظ، سلالات أي تحتوي على بعض الحمض النووي الأجنبية، يتم إنشاء. يتم خلط بناء البلازميد مع الخلايا السيانوبكتيريا وأخذ الحمض النووي بشكل طبيعي من قبل الكائن الحي. ويتم اختيار Transformants النمو على لوحات أجار التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة وراثى المسخ التحقق من PCR. البلازميدات الانتحارية لا يمكن نسخ ضمن سلالة من الفائدة. لذا فإن أي مستعمرات المقاومة للمضادات الحيوية سوف تنجم عن حدث إعادة التركيب حيث الجينات في المصالح في إدراجها في كروموسوم. لتوليد المسوخ لا تحمل علامات مميزة، متحولة ملحوظ ثم يتم خلط مع البلازميد انتحاري ثان يحتوي فقط على المناطق المحيطة 5 "و 3". ومع ذلك، إذا كان مطلوبا إدخال دنا غريب، البلازميد التي تتكون من 5 'و 3' المرافقة المناطق مع الكاسيت التي تحتوي على الجينات التي تهم تدرج بين هذه الشظايا الحمض النووي، ويمكن استخدامها. سيليction هو عن طريق النمو على لوحات أجار التي تحتوي على السكروز. كما السكروز قاتلة للخلايا عندما يتم التعبير عن الجين المنتج هيئة تنسيق المعونة، والخلايا الوحيدة التي البقاء على قيد الحياة هي تلك التي وقوع حدث إعادة التركيب الثاني، حيث الجين حساسية السكروز، بالإضافة إلى الجينات المقاومة للمضادات الحيوية، وقد معاد للخروج من كروموسوم وعلى البلازميد. ونتيجة لتبادل recombinational، يتم إدراج المناطق المحيطة وأي الحمض النووي بينهما في كروموسوم.
لقد استخدمت بنجاح هذه الأساليب لتوليد الطفرات الكروموسومية متعددة في نفس السلالة من Synechocystis ليرة سورية. PCC6803 (يشار إليها فيما Synechocystis) 13،14، ليعرض الطفرات نقطة واحدة في الجين 13 و للتعبير عن أشرطة الجينات. بينما الجيل بالضربة القاضية تحمل علامات وقد تجلى مسبق لعملنا في Synechocystis 15،16، وهي طريقة مفصلة، وساعد علىعرض مرئي من الخطوات الحاسمة، ليست متاحة للجمهور. لقد طبقنا أيضا نفس الأسلوب لتوليد بالضربة القاضية ملحوظة في cyanobacterium آخر نموذج، متعاقبات حبيبية ليرة سورية. PCC7002 (يشار إليها فيما متعاقبات حبيبية). يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة واضحة لتوليد المسوخ وبروتوكول السريع للتحقق من صحة وتخزين هذه السلالات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية في جيل من المسوخ تحمل علامات مميزة هي: 1) تصميم البلازميد دقيق لضمان فقط يتم تبديل المنطقة المستهدفة. 2) التأكد من أن العينات لا تزال ممحوضة، وخصوصا عندما تربيتها على السكروز. 3) الطلاء تحول الخلايا لتوليد متحولة ملحوظ في البداية على لوحات أجار BG11 ت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للخدمات البيئية رابطة التعليم الثقة، وعلم الأحياء الاصطناعية في كامبريدج صندوق SynBio وزارة العدل الاجتماعي والتمكين، حكومة الهند، للحصول على الدعم المالي.
Materials
| NaNO3 | Sigma | S5506 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| citric acid | Sigma | C0759 | |
| Na2EDTA | Fisher | EDT002 | |
| H3BO3 | Sigma | 339067 | |
| MnCl2.4H2O | Sigma | M3634 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma | Z4750 | |
| Na2MoO4.2H2O | Sigma | 331058 | |
| CuSO4.5H2O | Sigma | 209198 | |
| Co(NO3)2.6H2O | Sigma | 239267 | |
| Ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| Na2CO3 | Fisher | SODC001 | |
| TES | Sigma | T1375 | |
| NaHCO3 | Fisher | SODH001 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| cyanocobalamin | Sigma | 47869 | |
| Na2S2O3 | Sigma | 72049 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Sucrose | Fisher | SUC001 | |
| Petri dish 90 mm triple vented | Greiner | 633185 | |
| 0.2 µm filters | Sartorius | 16534 | |
| 100 mL conical flasks | Pyrex | CON004 | |
| Parafilm M 100 mm x38 m | Bemis | FIL003 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Phusion | F-530 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| DNA purification kit | MoBio | 12100-300 | |
| Restriction endonucleases | NEB | ||
| T4 ligase | Thermo Scientific | EL0011 | |
| Luria Bertani broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma | 60615 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| GeneJET plasmid miniprep kit | Thermo Scientific | K0503 | |
| 14 mL round-bottom tube | BD falcon | 352059 | |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| 425-600 µm glass beads | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fluorescent bulbs | Gro-Lux | 69 | |
| HT multitron photobioreactor | Infors |
References
- Zwirglmaier, K., et al. Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes. Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).
- Galloway, J. N., et al. Nitrogen cycles: past, present, and future. Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).
- Lea-Smith, D. J., et al. Contribution of cyanobacterial alkane production to the ocean hydrocarbon cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2015).
- Howe, C. J., Barbrook, A. C., Nisbet, R. E. R., Lockhart, P. J., Larkum, A. W. D. The origin of plastids. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 2675-2685 (2008).
- Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- McCormick, A. J., et al. Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system. Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).
- Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems. Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).
- Ducat, D. C., Way, J. C., Silver, P. A. Engineering cyanobacteria to generate high-value products. Trends Biotechnol. 29, 95-103 (2011).
- Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels. Curr Opin Biotechnol. 19, 235-240 (2008).
- Tan, L. T. Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery. Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).
- Volk, R. B., Furkert, F. H. Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth. Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).
- Scott, S. A., et al. Biodiesel from algae: challenges and prospects. Curr Opin Biotechnol. 21, 277-286 (2010).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity. Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).
- Lea-Smith, D. J., et al. Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities. Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).
- Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).
- Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 – Consequences for pigment biosynthesis and accumulation. J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).
- Castenholz, R. W. Culturing methods for Cyanobacteria. Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).
- Mitschke, J., et al. An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).
- Ried, J. L., Collmer, A. An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis. Gene. 57, 239-246 (1987).
- Vieira, J., Messing, J. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. 19, 259-268 (1982).
- Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).
- Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis?. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).
- Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002. J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).
- Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803. Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).
- Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria. Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).
- Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium. Appl Environ Microbiol. , (2015).
