모델 시아 노 박테리아 종의 표시 및 Markerless 돌연변이의 생성
Summary
Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.
Abstract
Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of ‘escape’ of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.
Introduction
시아 노 박테리아는 지구상의 거의 모든 자연 환경에서 발견되는 박테리아의 진화 고대하고 다양한 문이다. 해양 생태계에서 그들은 특히 풍부 탄소 고정 (1)의 약 절반, 바다에서의 질소 고정 2와 탄화수소 생산 3 톤의 수억의 대부분이 매년 회계, 많은 영양주기에 중요한 역할을한다. 엽록체, 진핵 조류와 식물의 광합성을 담당하는 세포 기관은 숙주 생물체 (4)에 의해 침몰 된 cyanobacterium에서 진화 한 것으로 보인다. 시아 노 박테리아는 식물에 보존되어 많은의 광합성, 전자 수송층 (5) 및 생화학 적 경로의 연구에 유용한 모델 생물을 증명했다. 추가 시아 노 박테리아에서 점점 그들의 안녕에 전기 7 및 산업용 화합물을, 6 바이오 연료, 식량 생산을 위해 8을 사용하고 있습니다물과 CO 2의 ghly 효율적으로 변환 태양 에너지 (9)를 사용하여 바이오 매스합니다. 많은 종은 잠재적으로 농업 생산에 영향을주지 않고 큰 규모로 성장시킬 수있는 시아 노 박테리아를 제안, 최소한의 영양분과 해수와 비 경작지에 재배 할 수있다. 어떤 종은 항진균, 항균 및 항암 화합물 10, 11를 포함하는 천연 제품의 소스입니다.
돌연변이 체를 생성 할 수있는 능력은 산업 목적을 위해 균주의 개발을위한 시아 노 박테리아 광합성, 생화학 및 생리학을 이해하는 키 필수적이다. 발표 된 연구의 대부분은 유전 적 관심 부위에 항생 물질 내성 카세트의 삽입에 의해 변형 균주 생성한다. 이것은 몇 항생제 내성 카세트 박테리아에서 사용할 수있는 등의 균주에 도입 할 수있는 돌연변이의 수를 제한한다. 항생제 재를 부여하는 유전자를 포함하는 균주sistance 바이오 연료 및 다른 낮은 값 (12)의 제품을 생산하는 유일한 비용 효과적인 수단이 될 가능성이 개방 연못 산업 생산을 위해 사용될 수 없다. 도장이 돌연변이 체의 생성은 이러한 한계를 극복한다. 표시없는 돌연변이 의도적으로 포함하지 않는 한, 외래 DNA를 함유하지 않고, 여러 번 조작 할 수있다. 따라서, 원하는대로 변형에 많은 변화를 생성 할 수있다. 또한, 수정 위치의 하류 유전자에 극성 효과는 유기체 (13)의보다 정확한 수정 있도록 최소화 될 수있다.
삭제할 유전자 측부 시아 노 박테리아 염색체에 지역에 두 개의 DNA 단편 동일한 포함하는 돌연변이 균주, 자살 플라스미드를 생성하려면 먼저 구성된다 (5 '및 3'측면 영역을 지칭). 두 유전자는 이러한 측면 영역 사이에 삽입된다. 이들 중 하나는 항생제 내성 단백질을 코딩; 둘째가 sacB, 어떤 자극 인코딩levansucrase uces, 화합물은 자당에 대한 민감성을 부여. 공정의 제 1 단계에서 표시 돌연변이 일부 외래 DNA를 함유 한 균주가 생성된다. 플라스미드 구조체는 시아 노 박테리아 세포와 혼합하고, DNA를 유기체에 의해 자연적으로 수행된다. 형질 전환은 적절한 항생제와 PCR에 의해 확인 돌연변이 유전자형을 포함하는 한천 플레이트에 성장에 의해 선택된다. 자살 플라스미드 관심 균주 내에서 복제 할 수 없습니다. 따라서 어떤 항생제 내성 콜로니는 관심있는 유전자의 염색체에 삽입함으로써 재조합 사건에 기인 할 것이다. 도장이 돌연변이 체를 생성하기 위해, 돌연변이 표시된 후 바로 5 '및 3'플 랭킹 영역을 포함하는 제 자살 플라스미드와 혼합된다. 외래 DNA의 삽입이 필요할 경우, 이러한 DNA 단편 사이에 삽입 관심의 유전자를 포함하는 카세트 영역 측면 5 '및 3'이루어지는 플라스미드를 사용할 수있다. 실리ction은 자당을 포함하는 한천 플레이트에 성장을 통해입니다. 가 sacB 유전자 산물이 발현되는 경우 수크로오스가 세포에 치명적이기 때문에, 생존 세포 만이 크로스 민감성 유전자, 항생제 내성 유전자 이외에에서 재결합되어있다 두번째 재조합 이벤트가 발생하는 것과이있다 염색체와 플라스미드. 재조합 교환 결과적으로, 측면 영역들과 이들 사이의 DNA가 염색체에 삽입되어있다.
우리는 성공적으로 스티스 특검팀의 동일한 균주에 여러 염색체 돌연변이를 생성하기 위해 이러한 방법을 사용했다. (이하 스티스라고 함) PCC6803 13, 14는 관심 (13)의 유전자로 유전자 카세트의 발현에 대한 하나의 점 돌연변이를 소개합니다. 도장이 녹아웃의 생성 스티스 15,16 상세한 방법에서 우리의 작업에 앞서 입증되었지만, 힘 입어중요한 단계의 시각적 표현은 공개적으로 사용할 수 없습니다. 우리는 또한 다른 모델 cyanobacterium, 인 Synechococcus 특검팀에 표시된 녹아웃의 생성을 위해 동일한 방법을 적용했습니다. PCC7002 (이하 인 Synechococcus 함). 이 프로토콜은 돌연변이 검증 이들 균주를 저장하기위한 신속한 프로토콜을 생성하기위한 명확하고 간단한 방법을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
표시되지 않은 돌연변이의 발생에 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 1)주의 플라스미드 디자인은 대상 지역이 변경 될 수 있도록; 2) 샘플 자당에, 특히 배양 무균 유지 보장; 3) 도금 처음에 24 시간 이상 한천 플러스 항생제 첨가하여 항생제, 부족 BG11 아가 플레이트 상에 표시 돌연변이 생성 세포를 형질 전환; 4) 배양은 BG11 플러스 자당 한천 플레이트에 도금하기 전에 4 완전 일 돌연변이 표시 :…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 환경 서비스 협회 교육 신뢰, 금융 지원을위한 캠브리지 오피씨 기금에서 합성 생물학 및 사회 정의 및 능력을 키우고, 인도 정부의 교육부에 감사하고 있습니다.
Materials
| NaNO3 | Sigma | S5506 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| citric acid | Sigma | C0759 | |
| Na2EDTA | Fisher | EDT002 | |
| H3BO3 | Sigma | 339067 | |
| MnCl2.4H2O | Sigma | M3634 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma | Z4750 | |
| Na2MoO4.2H2O | Sigma | 331058 | |
| CuSO4.5H2O | Sigma | 209198 | |
| Co(NO3)2.6H2O | Sigma | 239267 | |
| Ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| Na2CO3 | Fisher | SODC001 | |
| TES | Sigma | T1375 | |
| NaHCO3 | Fisher | SODH001 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| cyanocobalamin | Sigma | 47869 | |
| Na2S2O3 | Sigma | 72049 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Sucrose | Fisher | SUC001 | |
| Petri dish 90 mm triple vented | Greiner | 633185 | |
| 0.2 µm filters | Sartorius | 16534 | |
| 100 mL conical flasks | Pyrex | CON004 | |
| Parafilm M 100 mm x38 m | Bemis | FIL003 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Phusion | F-530 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| DNA purification kit | MoBio | 12100-300 | |
| Restriction endonucleases | NEB | ||
| T4 ligase | Thermo Scientific | EL0011 | |
| Luria Bertani broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma | 60615 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| GeneJET plasmid miniprep kit | Thermo Scientific | K0503 | |
| 14 mL round-bottom tube | BD falcon | 352059 | |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| 425-600 µm glass beads | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fluorescent bulbs | Gro-Lux | 69 | |
| HT multitron photobioreactor | Infors |
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