Model siyanobakteri Türlerinde İşaretli ve belirtisiz Mutants Üretimi
Summary
Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.
Abstract
Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of ‘escape’ of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.
Introduction
Siyanobakteriler yeryüzünde hemen her doğal ortamda bulunan bakteri evrimsel eski ve çeşitli filum vardır. Deniz ekosistemlerinin onlar özellikle bol ve karbon fiksasyonu 1 yaklaşık yarısında, okyanuslardaki azot fiksasyonu 2 ve hidrokarbon üretimi 3 ton yüzmilyonlarca çoğunluğu yıllık muhasebe, birçok besin döngüleri önemli bir rol oynamaktadır. Kloroplastlar, ökaryot alglerin ve bitkilerde fotosentez için sorumlu organel bir konak organizmada 4 tarafından yuttu bir siyanobakteriye evrimleşmiş olması muhtemeldir. Siyanobakteri tesislerinde muhafaza birçoğu fotosentez, elektron taşıma 5 ve biyokimyasal yollar çalışma için faydalı model organizmalar kanıtlamıştır. Ilave siyanobakteriler giderek dolayı hi, elektrik 7 ve endüstriyel bileşikleri, 6 biyoyakıt, gıda üretimi için 8 kullanılmaktadırsu ve CO 2 ghly verimli dönüşüm güneş enerjisi 9 kullanarak biyokütle. Birçok tür potansiyel tarımsal üretim etkilemeden büyük ölçekli yetiştirilen olabileceğini siyanobacteria düşündüren, en az besin ve deniz suyu olmayan ekilebilir arazi üzerinde yetiştirilebilir. Bazı türler de mantar önleyici, anti-bakteriyel ve anti-kanser bileşikleri 10,11 gibi doğal ürünler, kaynaklarıdır.
mutantlar oluşturmak için yeteneği endüstriyel amaçlı suşları geliştirilmesi için siyanobakteri fotosentez, biyokimya ve fizyoloji, anlamanın anahtarı ve esastır. yayınlanan çalışmaların çoğunluğu genetik ilgi siteye bir antibiyotik direnç kasetinin sokulmasıyla suşları modifiye oluşturun. Bu sadece birkaç antibiyotik direnç kaseti siyanobakteriler kullanım için uygun olarak bir hücreye dahil edilebilir mutasyon sayısını sınırlar. Antibiyotik yeniden kazandıran genler ihtiva eden suşlardirencin biyoyakıt ve diğer düşük değerli ürünler 12 üretmek için sadece maliyet-etkili bir araç olması muhtemeldir açık havuzlarda sanayi üretimi için kullanılamaz. işaretsiz mutantların nesil bu kısıtlamaların üstesinden. Işaretsiz mutantlar kasten dahil olmadıkça, hiçbir yabancı DNA'yı içerir ve birden çok kez manipüle edilebilir. Nedenle arzu edilen bir suş olarak birçok değişiklik elde etmek mümkündür. Buna ek olarak, modifikasyon bölgesinden akım-aşağı genin kutup etkisi organizma 13 daha hassas modifikasyonu sağlayan en aza indirilebilir.
Silinecek gene komşu siyanobakteri kromozomda bölgelere İki DNA parçası aynı içeren mutant suşları, intihar plasmidleri oluşturmak için ilk inşa edilir (5 've 3' yan bölge olarak da adlandırılır). Iki gen daha sonra bu yan bölgeler arasına yerleştirilir. Bunlardan biri, bir antibiyotik direnç proteini kodlar İkinci SacB, hangi eşya kodlarlevansükraz uces, bir bileşik sukroz duyarlılık kazandıran. Işlemin birinci aşamasında, işaretlenmiş mutantlar, bazı yabancı DNA'yı ihtiva eden, yani suşlar oluşturulur. plazmid yapılarında siyanobakteriyel hücreleri ile karıştırılır, ve DNA organizmanın doğal olarak alınır. Transformantlar uygun antibiyotiği ve PCR ile teyit mutant genotip ihtiva eden agar plakaları üzerinde büyüme ile seçilir. İntihar plazmidler ilgi suşu içinde çoğaltma yapamaz. Bu nedenle, herhangi bir antibiyotik dirençli koloniler ilgi konusu genin kromozom içine yerleştirilir, böylece bir rekombinasyon olayı ile sonuçlanacaktır. İşaretlenmemiş mutantlan oluşturmak için, belirgin bir mutantı sadece 5 've 3' yan bölgelerini içeren ikinci bir intihar plasmidi ile karıştırılır. Yabancı DNA'nın sokulması gereklidir, ancak, söz konusu DNA fragmanları arasındaki yerleştirilen ilgili genleri içeren bir kaset ile yandan kuşatma bölgeleri, 5 've 3' içeren bir plazmid, kullanılabilir. Selection sukroz içeren agar plakaları üzerinde büyüme yoluyladır. SacB gen ürünü ifade edildiğinde sükroz hücreleri için öldürücü olduğu için, hayatta sadece hücreleri sükroz duyarlılığı geni, antibiyotik direnç genine ek olarak, takım rekombine edilmiş ve böylece ikinci bir rekombinasyon olayı hangi olanlar vardır kromozom ve plazmid üzerine. rekombinasyonel değişiminin bir sonucu olarak, kuşatıcı bölge ve bunların arasında herhangi bir DNA kromozom içine yerleştirilir.
Biz başarıyla Synechocystis sp aynı suşu birden kromozomal mutasyon üretmek için bu yöntemleri kullandık. (Bundan sonra Synechocystis olarak anılacaktır) PCC6803 13,14 çıkar 13 bir gen içine ve gen kasetleri ekspresyonu için tek nokta mutasyonların katılması için. İşaretlenmemiş tırnakları üretilmesi Synechocystis 15,16, detaylı yöntemde çalışmalarımızda önce gösterilmiştir birlikte, destekliKritik adımlar görsel sunum, kamuya açık değildir. Biz de başka bir model siyanobakterisine Synechococcus sp belirgin Knockouts üretimi için aynı yöntemi uyguladık. PCC7002 (bundan sonra Synechococcus olarak anılacaktır). Bu protokol mutantlar ve doğrulama ve bu suşları saklamak için hızlı bir protokol oluşturmak için bir açık, basit bir yöntem sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
işaretsiz mutantların nesil en kritik adımlar şunlardır: 1) dikkatli plazmid tasarımı sadece hedeflenen bölge değişmiş sağlamak; 2) numuneler sukroz üzerine, özellikle kültür aksenik kalmasını sağlamak; 3) ile kaplanmış, ilk 24 saat sonra ağarı artı antibiyotik ilave edilir antibiyotikler, eksik BG11 agar plakaları üzerine işaretlenir mutant üretimi için hücrelerin transforme; 4) kültür BG11 artı sakaroz agar plakaları üzerinde kaplama öncesinde 4 tam gün mutantlar işaretlenmiş: 5)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Çevre Hizmetleri Birliği Eğitim Vakfı'nın mali destek için Cambridge SynBio fonda Sentetik Biyoloji ve Sosyal Adalet ve Güçlendirilmesi, Hindistan Hükümeti Bakanlığı'na müteşekkiriz.
Materials
| NaNO3 | Sigma | S5506 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| citric acid | Sigma | C0759 | |
| Na2EDTA | Fisher | EDT002 | |
| H3BO3 | Sigma | 339067 | |
| MnCl2.4H2O | Sigma | M3634 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma | Z4750 | |
| Na2MoO4.2H2O | Sigma | 331058 | |
| CuSO4.5H2O | Sigma | 209198 | |
| Co(NO3)2.6H2O | Sigma | 239267 | |
| Ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| Na2CO3 | Fisher | SODC001 | |
| TES | Sigma | T1375 | |
| NaHCO3 | Fisher | SODH001 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| cyanocobalamin | Sigma | 47869 | |
| Na2S2O3 | Sigma | 72049 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Sucrose | Fisher | SUC001 | |
| Petri dish 90 mm triple vented | Greiner | 633185 | |
| 0.2 µm filters | Sartorius | 16534 | |
| 100 mL conical flasks | Pyrex | CON004 | |
| Parafilm M 100 mm x38 m | Bemis | FIL003 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Phusion | F-530 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| DNA purification kit | MoBio | 12100-300 | |
| Restriction endonucleases | NEB | ||
| T4 ligase | Thermo Scientific | EL0011 | |
| Luria Bertani broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma | 60615 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| GeneJET plasmid miniprep kit | Thermo Scientific | K0503 | |
| 14 mL round-bottom tube | BD falcon | 352059 | |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| 425-600 µm glass beads | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fluorescent bulbs | Gro-Lux | 69 | |
| HT multitron photobioreactor | Infors |
References
- Zwirglmaier, K., et al. Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes. Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).
- Galloway, J. N., et al. Nitrogen cycles: past, present, and future. Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).
- Lea-Smith, D. J., et al. Contribution of cyanobacterial alkane production to the ocean hydrocarbon cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2015).
- Howe, C. J., Barbrook, A. C., Nisbet, R. E. R., Lockhart, P. J., Larkum, A. W. D. The origin of plastids. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 2675-2685 (2008).
- Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- McCormick, A. J., et al. Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system. Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).
- Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems. Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).
- Ducat, D. C., Way, J. C., Silver, P. A. Engineering cyanobacteria to generate high-value products. Trends Biotechnol. 29, 95-103 (2011).
- Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels. Curr Opin Biotechnol. 19, 235-240 (2008).
- Tan, L. T. Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery. Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).
- Volk, R. B., Furkert, F. H. Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth. Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).
- Scott, S. A., et al. Biodiesel from algae: challenges and prospects. Curr Opin Biotechnol. 21, 277-286 (2010).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity. Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).
- Lea-Smith, D. J., et al. Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities. Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).
- Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).
- Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 – Consequences for pigment biosynthesis and accumulation. J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).
- Castenholz, R. W. Culturing methods for Cyanobacteria. Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).
- Mitschke, J., et al. An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).
- Ried, J. L., Collmer, A. An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis. Gene. 57, 239-246 (1987).
- Vieira, J., Messing, J. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. 19, 259-268 (1982).
- Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).
- Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis?. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).
- Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002. J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).
- Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803. Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).
- Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria. Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).
- Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium. Appl Environ Microbiol. , (2015).
