Generación de mutantes sin marcadores marcados y en el modelo de especies de cianobacterias
Summary
Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.
Abstract
Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of ‘escape’ of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.
Introduction
Las cianobacterias son un phylum antigua y diversa evolutivamente de bacterias que se encuentran en casi todos los medio natural en la Tierra. En los ecosistemas marinos son particularmente abundantes y juegan un papel clave en muchos ciclos de nutrientes, lo que representa aproximadamente la mitad de la fijación de carbono 1, la mayoría de la fijación de nitrógeno 2 y cientos de millones de toneladas de producción de hidrocarburos 3 en los océanos anualmente. Cloroplastos, el orgánulo responsable de la fotosíntesis de las algas y las plantas eucariota, es probable que hayan evolucionado a partir de una cianobacteria que fue engullido por un organismo huésped 4. Las cianobacterias han demostrado organismos modelo útil para el estudio de la fotosíntesis, transporte de electrones y 5 vías bioquímicas, muchos de los cuales se conservan en las plantas. Además cianobacterias cada vez se utilizan para la producción de alimentos, los biocombustibles 6, 7 y electricidad compuestos industriales 8, debido a su altaghly conversión eficiente del agua y CO 2 a la biomasa utilizando la energía solar 9. Muchas especies pueden cultivarse en tierras no cultivables con nutrientes mínimos y el agua de mar, lo que sugiere que las cianobacterias potencialmente podrían ser crecido a gran escala sin afectar la producción agrícola. Ciertas especies son también fuentes de productos naturales, incluidos los compuestos antifúngicos, antibacterianos y anti-cáncer 10,11.
La capacidad de generar mutantes es clave para entender la fotosíntesis de cianobacterias, bioquímica y fisiología, y esencial para el desarrollo de cepas con fines industriales. La mayoría de los estudios publicados generate modificado genéticamente cepas mediante la inserción de un casete de resistencia a los antibióticos en el sitio de interés. Esto limita el número de mutaciones que pueden introducirse en una cepa, como sólo unos casetes de resistencia a antibióticos están disponibles para su uso en cianobacterias. Las cepas que contienen los genes que confieren re antibióticoresistencia no puede ser utilizado para la producción industrial en estanques abiertos, lo que es probable que sea el único medio rentables para la producción de biocombustibles y otros productos de bajo valor 12. La generación de mutantes no marcados supera estas limitaciones. mutantes no marcados no contienen ADN extraño, excepto si se incluye intencionalmente, y se pueden manipular varias veces. Por lo tanto es posible generar tantas alteraciones en una cepa como se desee. Además, los efectos polares de genes aguas abajo del sitio de modificación pueden minimizarse, lo que permite la modificación más preciso del organismo 13.
Para generar cepas mutantes, plásmidos suicidas que contienen dos fragmentos de ADN idéntica a las regiones en el cromosoma de cianobacterias que flanquean el gen a eliminar (denominado el 5 'y 3' flanqueantes) se construyó primero. Dos genes se insertan entonces entre estas regiones flanqueantes. Uno de ellos codifica una proteína de resistencia a los antibióticos; la segunda codifica SacB, que produces levansucrasa, un compuesto que confiere sensibilidad a la sacarosa. En la primera etapa del proceso, los mutantes marcados, es decir, las cepas que contienen algo de ADN externa, se generan. La construcción de plásmido se mezcla con las células de cianobacterias y el ADN se recogió de forma natural por el organismo. Los transformantes se seleccionaron por crecimiento en placas de agar que contienen el antibiótico apropiado y el genotipo mutante verificada por PCR. plásmidos suicidas no pueden replicarse dentro de la cepa de interés. Por lo tanto cualquier colonias resistentes a los antibióticos serán el resultado de un evento de recombinación mediante el cual el gen de interés en insertado en el cromosoma. Para generar mutantes no marcados, el mutante marcada se mezcla a continuación con un segundo plásmido suicida que contiene sólo las regiones flanqueantes 5 'y 3'. Sin embargo, si se requiere la inserción de ADN extraño, un plásmido que consiste en el 5 'y 3' que flanquean las regiones con un casete que contiene los genes de interés insertado entre estos fragmentos de ADN, se puede utilizar. selección es a través del crecimiento en placas de agar que contienen sacarosa. Como la sacarosa es letal para las células cuando se expresa el producto del gen sacB, las únicas células que sobreviven son aquellos en los que se ha producido un segundo suceso de recombinación, con lo cual el gen de sensibilidad sacarosa, además de el gen de resistencia a los antibióticos, se ha recombinado de la cromosoma y en el plásmido. Como consecuencia del intercambio de recombinación, las regiones flanqueantes y cualquier ADN entre ellos se insertan en el cromosoma.
Hemos utilizado con éxito estos métodos para generar múltiples mutaciones cromosómicas en la misma cepa de Synechocystis sp. PCC6803 (en adelante como Synechocystis) 13,14, para introducir mutaciones puntuales en un gen de interés y 13 para la expresión de cassettes de genes. Mientras que la generación de knockouts sin marcar se ha demostrado con anterioridad a nuestro trabajo en Synechocystis 15,16, un método detallado, con la ayuda deuna presentación visual de los pasos críticos, no está disponible públicamente. También hemos aplicado el mismo método para la generación de knockouts marcadas en otro modelo de cianobacteria, Synechococcus sp. PCC7002 (en lo sucesivo, Synechococcus). Este protocolo proporciona un método claro y sencillo para la generación de mutantes y un protocolo rápido para la validación y almacenamiento de estas cepas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más importantes en la generación de mutantes no marcados son: 1) Diseño de plásmido cuidado para asegurar que sólo se altera la región objetivo; 2) garantizar que las muestras permanezcan axénicos, especialmente cuando se cultivan en sacarosa; 3) placas células de marcado generación mutante transformada inicialmente en placas de agar BG11 que carecen de antibióticos, seguido de la adición de agar más antibióticos 24 horas más tarde; 4) cultivar marcado mutantes para 4 días completos antes de la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a la Asociación de Servicios Medioambientales Fiduciario para la Educación, la biología sintética en el fondo de la Biología Sintética Cambridge y el Ministerio de Justicia Social y Empoderamiento, Gobierno de la India, por el apoyo financiero.
Materials
| NaNO3 | Sigma | S5506 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| citric acid | Sigma | C0759 | |
| Na2EDTA | Fisher | EDT002 | |
| H3BO3 | Sigma | 339067 | |
| MnCl2.4H2O | Sigma | M3634 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma | Z4750 | |
| Na2MoO4.2H2O | Sigma | 331058 | |
| CuSO4.5H2O | Sigma | 209198 | |
| Co(NO3)2.6H2O | Sigma | 239267 | |
| Ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| Na2CO3 | Fisher | SODC001 | |
| TES | Sigma | T1375 | |
| NaHCO3 | Fisher | SODH001 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| cyanocobalamin | Sigma | 47869 | |
| Na2S2O3 | Sigma | 72049 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Sucrose | Fisher | SUC001 | |
| Petri dish 90 mm triple vented | Greiner | 633185 | |
| 0.2 µm filters | Sartorius | 16534 | |
| 100 mL conical flasks | Pyrex | CON004 | |
| Parafilm M 100 mm x38 m | Bemis | FIL003 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Phusion | F-530 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| DNA purification kit | MoBio | 12100-300 | |
| Restriction endonucleases | NEB | ||
| T4 ligase | Thermo Scientific | EL0011 | |
| Luria Bertani broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma | 60615 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| GeneJET plasmid miniprep kit | Thermo Scientific | K0503 | |
| 14 mL round-bottom tube | BD falcon | 352059 | |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| 425-600 µm glass beads | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fluorescent bulbs | Gro-Lux | 69 | |
| HT multitron photobioreactor | Infors |
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