Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente
Summary
Qui vi presentiamo un protocollo per indagare genoma metilazione del DNA in studi clinici di screening dei pazienti su larga scala utilizzando il metil-Binding sequenziamento del DNA di cattura (MBDCap-ss o MBD-ss), la tecnologia e la successiva analisi bioinformatica pipeline.
Abstract
La metilazione è una delle modificazioni epigenetiche essenziali al DNA, che è responsabile per la precisa regolazione dei geni necessari per lo sviluppo stabile e differenziazione dei diversi tipi di tessuto. Disregolazione di questo processo è spesso il segno distintivo di varie malattie come il cancro. Qui, si delineano uno dei recenti tecniche di sequenziamento, Metil-Binding DNA Capture sequenziamento (MBDCap-ss), utilizzato per quantificare la metilazione in vari tessuti normali e di malattia per i grandi coorti di pazienti. Descriviamo un protocollo dettagliato di questo approccio arricchimento affinità con un oleodotto bioinformatica per raggiungere quantificazione ottimale. Questa tecnica è stata utilizzata per sequenziare centinaia di pazienti in vari tipi di cancro come parte del progetto 1.000 methylome (Cancer Methylome System).
Introduction
Regolazione epigenetica di geni attraverso metilazione del DNA è uno dei meccanismi essenziali necessari per determinare il destino della cellula dalla differenziazione stabile di diversi tipi di tessuto nel corpo 1. Disregolazione di questo processo è stato conosciuto per causare varie malattie tra cui il cancro 2.
Questo processo comporta principalmente l'aggiunta di gruppi metilici sul residuo citosina in dinucleotidi CpG del DNA 3. Esistono alcune tecniche diverse attualmente utilizzate per indagare questo meccanismo, ciascuno con i propri vantaggi come indicato in molti studi 2-8. Qui discuteremo una di queste tecniche chiamati Metil-Binding DNA Capture sequenziamento (MBDCap-ss), dove utilizziamo una tecnica di affinità arricchimento per identificare le regioni metilato del DNA. Questa tecnica si basa sulla capacità metil-legame della proteina MBD2 per arricchire i frammenti di DNA genomico contenenti denaturato siti CpG. Utilizziamo un kit di arricchimento DNA metilato commercialeper l'isolamento di tali regioni metilati. Il nostro laboratorio ha proiettato in centinaia di campioni di pazienti con questa tecnica e qui mettiamo a disposizione un protocollo ottimizzato completo, che può essere utilizzato per studiare grandi coorti di pazienti.
Come evidente con qualsiasi tecnologia di sequenziamento di prossima generazione, MBDCap-ss richiede anche un approccio bioinformatico specifiche al fine di quantificare con precisione i livelli di metilazione attraverso i campioni. Ci sono stati molti studi recenti, nel tentativo di ottimizzare il processo di normalizzazione e l'analisi dei dati di sequenziamento 9, 10. In questo protocollo, dimostriamo uno di questi metodi di attuazione di un approccio unico di recupero lettura – LONUT – seguita dalla normalizzazione lineare di ogni campione, al fine di consentire il confronto imparziali attraverso gran numero di campioni di pazienti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica MBDCap-seq è un approccio arricchimento affinità 3, considerata un'alternativa economica nell'ambito delle indagini coorti con un grande numero di pazienti 15. Il gasdotto presentato qui descrive un approccio globale da approvvigionamento di esempio per l'analisi e l'interpretazione dei dati. Uno dei passi più importanti è la creazione di una procedura di amplificazione PCR per migliorare l'efficienza della PCR delle regioni GC arricchito nel genoma come questo è dove si verifica la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è sostenuto da CPRIT Research Training Award RP140105, così come in parte sostenuto da Stati Uniti National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni R01 GM114142 e da William & Ella Owens Medical Research Foundation.
Materials
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3M sodium acetate pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100ml |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
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