Метил-связывающий захват Секвенирование ДНК для ТКАНЕЙ Patient
Summary
Здесь мы приводим протокол для исследования генома широкого метилирование ДНК в крупномасштабных клинических исследованиях пациентов скрининга с использованием Метил-Binding ДНК захвата секвенирование (MBDCap-Seq или MBD-Seq) технологии и анализ трубопровода последующих биоинформатики.
Abstract
Метилирование является одним из основных эпигенетических модификаций ДНК, который отвечает за точное регулирование генов, необходимых для устойчивого развития и дифференциации различных типов тканей. Нарушение регуляции этого процесса часто является признаком различных заболеваний, таких как рак. Здесь мы опишем один из последних методов секвенирования, Метил-Binding ДНК захвата секвенирование (MBDCap-Seq), используемый для количественного определения метилирования в различных нормальных и болезненных тканей для больших когорт пациентов. Мы описываем подробный протокол этого сродства подхода по обогащению наряду с биоинформатики трубопровода для достижения оптимального количественного определения. Этот метод был использован для секвенирования сотни пациентов через различные виды рака, как часть methylome проекта 1000 (Рак системы Methylome).
Introduction
Эпигенетическая регуляция генов через метилирование ДНК является одним из основных механизмов , необходимых для определения судьбы клеток путем стабильной дифференциации различных типов тканей в организме 1. Дисрегуляция этого процесса, как известно, вызывают различные заболевания , включая рак 2.
Этот процесс в основном включает добавление метильных групп на остатке цитозина в динуклеотидах CpG ДНК 3. Есть несколько различных методов , используемых в настоящее время для изучения этого механизма, каждый из которых имеет свои преимущества , как описано во многих исследованиях 2-8. Здесь мы обсудим один из этих методов, называемых Метил-связывающих ДНК Захват секвенирование (MBDCap-сл), где мы используем технологию обогащения сродством для идентификации метилированные области ДНК. Этот метод основывается на метил-связывающую способность белка MBD2 обогащать для геномных фрагментов ДНК, содержащих метилированные сайты CpG. Мы используем коммерческий денатурат набор по обогащению ДНКдля выделения этих метилированных регионов. Наша лаборатория скринингу сотни образцов пациентов, используя эту технику и здесь мы предлагаем комплексный оптимизированный протокол, который может быть использован для изучения больших когорт пациентов.
Как видно с любой технологией секвенирования следующего поколения, MBDCap-сл также требует подхода конкретных биоинформатики для того, чтобы точно определить их уровни метилирования по образцам. Там было много недавних исследований в целях оптимизации процесса нормализации и анализа данных секвенирования 9, 10. В этом протоколе, мы демонстрируем один из этих методов, реализующих уникальный подход для восстановления чтения – LONUT – с последующей линейной нормализации каждого образца, с тем чтобы объективные сравнения между большим количеством образцов пациентов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методика MBDCap-сл представляет собой подход , обогащение сродства 3, рассматривается как экономически эффективную альтернативу при исследовании когорты с большим количеством пациентов 15. Трубопровод, представленный здесь описывает комплексный подход от закупок образца для анализа и и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке CPRIT Research Training Award RP140105, а также при частичной поддержке Национального института здоровья (NIH) грантов R01 GM114142 и Фонда исследований Уильям и Элла Owens Medical.
Materials
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3M sodium acetate pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100ml |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
References
- Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
- Nair, S. S., et al. Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias. Epigenetics. 6, 34-44 (2011).
- Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H. Methods in DNA methylation profiling. Epigenomics. 1, 331-345 (2009).
- Clark, C., et al. A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling. PLoS One. 7, e50233 (2012).
- Walker, D. L., et al. DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip. Epigenomics. , 1-16 (2015).
- Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing. Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).
- Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome. Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).
- Brinkman, A. B., et al. Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq. Methods. 52, 232-236 (2010).
- Wang, R., et al. LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data. PLoS One. 8, e67788 (2013).
- Gu, F., et al. CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers. PLoS One. 8, e60980 (2013).
- Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data. Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).
- Jadhav, R. R., et al. Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer. Clin. Epigenetics. 7, 13 (2015).
- Hsu, Y. T., et al. Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer. Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).
- Wang, Y. V., et al. Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis. Sci. Rep. , (2015).
- Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond. Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).
- Riebler, A., et al. BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach. Genome Biol. 15, R35 (2014).
