환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱
Summary
여기서 우리는 프로토콜이 메틸 바인딩 DNA 캡처 시퀀싱 (MBDCap-서열 또는 MBD-SEQ) 기술과 이후의 생물 정보학 분석 파이프 라인을 사용하여 대규모 임상 환자 스크리닝 연구에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하기 위해 제시한다.
Abstract
메틸화 다른 조직 유형의 안정 발생과 분화에 필요한 유전자의 정확한 조절을 담당하는 DNA에 필수적인 후생 변형 중 하나이다. 이 과정의 이상 조절은 종종 암과 같은 다양한 질환의 특징이다. 여기서, 우리는 최근 시퀀싱 기술을 간략 메틸 – 바인딩 많은 환자 집단에 대한 다양한 정상 및 질병 조직에 메틸화를 정량화하는 데 사용되는 캡쳐 DNA 시퀀싱 (MBDCap-SEQ)를. 우리는 최적의 정량화를 달성하기 위해 생물 정보학 파이프 라인과 함께이 친 화성 농축 방법의 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 1000 methylome 프로젝트 (암 Methylome 시스템)의 일부로서 다양한 종류의 암 환자에 걸쳐 수백 시퀀스 사용되고있다.
Introduction
DNA 메틸화를 통해 유전자의 후생 유전 학적 조절은 본체 (1)의 서로 다른 조직 유형의 안정에 의해 분화 세포의 운명을 결정하기 위해 필요한 필수 메커니즘이다. 이 과정의 이상 조절이 암을 비롯한 다양한 질환을 일으키는 것으로 알려져있다.
이 프로세스는 주로 DNA (3)의 CpG 디 뉴클레오티드의 시토신 잔기에 메틸기의 첨가를 포함한다. 현재 많은 연구 2-8에서 설명한 바와 같이 각각 자신의 장점을 갖는 이러한 메카니즘을 조사하기 위해 사용되는 몇 가지 방법이있다. 여기에서 우리는 우리가 DNA의 메틸화 지역을 식별하는 친 화성 농축 기술을 사용 (MBDCap-SEQ) 메틸 바인딩 DNA 캡처 순서라는 이러한 기술 중 하나를 설명합니다. 이 기술은 메틸화 된 CpG 부위를 함유하는 게놈 DNA 단편에 대한 농축하는 MBD2 단백질 메틸 결합능에 만든다. 우리는 상업 메틸화 된 DNA 농축 키트를 활용이러한 메틸화 영역의 분리를위한. 우리의 실험은이 기술을 사용하여 환자 샘플 수백 스크리닝하고 여기 큰 환자 집단을 조사하는데 사용될 수있는 최적화 된 광범위한 프로토콜을 제공한다.
모든 차세대 시퀀싱 기술 명백한 바와 같이, MBDCap-SEQ 또한 정확하게 샘플 통해 메틸화의 수준을 정량화하기 위해 특정 바이오 인포 매틱스 방법을 필요로한다. 시퀀스 데이터 (9), (10)의 정규화 및 분석 프로세스를 최적화하기 위해 많은 최근의 연구가 있었다. LONUT – – 환자 샘플의 다수에 걸쳐 편향 비교를 가능하게하기 위해, 각 샘플의 선형 정규화 뒤에이 프로토콜에서는 고유 판독 복구 방식을 구현하는 방법 중 하나를 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
MBDCap-SEQ 기술은 환자 (15)의 다수 집단을 조사 할 때 비용 효율적인 대안으로 고려 친 화성 농축 방법 (3)이다. 여기에 제시된 파이프 라인은 데이터 분석 및 해석에 샘플 조달에서 포괄적 인 접근 방식을 설명합니다. 가장 중요한 단계 중 하나는 DNA 메틸화가 발생하는 곳이므로 게놈에서 GC 풍부 영역의 PCR 효율을 향상시키기 위해 PCR 증폭 과정을 설정한다. 또한, 시퀀싱 후, 각각의 샘플이 유일하게…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 CPRIT 연구 교육 상 RP140105에서 지원뿐만 아니라 부분적으로 건강의 미국 국립 보건원 (NIH) R01 GM114142을 부여하여 윌리엄 & 엘라 오웬스 의학 연구 재단이 지원됩니다.
Materials
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3M sodium acetate pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100ml |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
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