Summary

Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Published: October 31, 2016
doi:

Summary

Aqui apresentamos um protocolo para investigar a metilação do DNA do genoma ampla em grande escala estudos de triagem de pacientes clínicos utilizando o Metil-Binding tecnologia de sequenciamento de DNA Captura (MBDCap-seq ou MBD-seq) eo gasoduto análise bioinformática subsequentes.

Abstract

A metilação é uma das modificações epigenética essenciais para o DNA, o qual é responsável pela regulação precisa dos genes necessários para o desenvolvimento e diferenciação estável de diferentes tipos de tecidos. A desregulação deste processo é frequentemente a característica de diversas doenças como o cancro. Aqui, nós descrevemos uma das técnicas de sequenciação recentes, Metil-Binding sequenciação de ADN de captura (MBDCap-SEQ), usada para quantificar a metilação em vários tecidos normais e de doença para grandes grupos de pacientes. Descreve-se um protocolo detalhado desta abordagem de enriquecimento por afinidade ao longo de uma conduta bioinformática para alcançar quantificação ideal. Esta técnica tem sido utilizada para sequenciar centenas de pacientes em vários tipos de câncer, como parte do projeto methylome 1.000 (Sistema Methylome Câncer).

Introduction

Regulação epigenética de genes por meio de metilação do ADN é um dos mecanismos essenciais necessários para determinar o destino da célula por diferenciação estável de diferentes tipos de tecidos do corpo 1. A desregulação deste processo tem sido conhecido por causar diversas doenças, incluindo o cancro 2.

Este processo envolve, principalmente, a adição de grupos metilo no resíduo de citosina nos dinucleótidos CpG de ADN 3. Existem algumas técnicas diferentes, actualmente utilizados para investigar este mecanismo, tendo cada um as suas próprias vantagens, conforme descrito em muitos estudos 2-8. Aqui vamos discutir uma destas técnicas chamados metil-Binding Captura de sequenciamento de DNA (MBDCap-seq), onde usamos uma técnica de enriquecimento de afinidade para identificar regiões metiladas do DNA. Esta técnica baseia-se na capacidade de ligação de metilo da proteína MBD2 para enriquecer os fragmentos de DNA genómico contendo locais CpG metilados. Nós utilizamos um kit de enriquecimento de DNA metilado comercialpara o isolamento destas regiões metiladas. O nosso laboratório fez a triagem centenas de amostras de pacientes, utilizando esta técnica e aqui nós fornecemos um protocolo optimizado abrangente, que pode ser usado para investigar grandes grupos de pacientes.

Como é evidente, com qualquer tecnologia de sequenciamento de próxima geração, MBDCap-seq também requer uma abordagem bioinformática específicos, a fim de quantificar com precisão os níveis de metilação através das amostras. Tem havido muitos estudos recentes em um esforço para otimizar o processo de normalização e análise dos dados de sequenciamento 9, 10. Neste protocolo, demonstramos um destes métodos de aplicação de uma abordagem única de recuperação de leitura – LONUT – seguido pela normalização linear de cada amostra, a fim de permitir comparações imparciais toda grande número de amostras de doentes.

Protocol

Todos os tecidos são obtidos após a aprovação da comissão Institutional Review Board e quando todos os participantes consentiram em ambas as análises moleculares e estudos de acompanhamento. Os protocolos são aprovados pela Comissão de Estudos Humanos da Universidade do Texas Health Science Center em San Antonio. 1. Captação de ligação ao ADN de metilo (MBDCap) Coleta de amostras e isolamento de ADN Recolha tumor granel ou amostras de tecidos normais a partir de a…

Representative Results

Usámos MBDCap-SEQ de estudar as alterações de metilação do DNA em um grande número de pacientes de diversos tipos de cancro incluindo cancro da mama 12, 13 do endométrio, próstata 14, e cancros do fígado, entre outros. Aqui demonstramos algumas informações a partir do estudo do cancro da mama publicou recentemente 12. Neste exemplo, utilizou-se toda a abordagem de sequenciação do genoma para identificar ilhas CpG que são diferencialmente metilados no tumor em relação à perpendicul…

Discussion

A técnica MBDCap-seq é uma abordagem de enriquecimento de afinidade 3, considerada como uma alternativa de custo eficaz quando se investiga coortes com um grande número de pacientes 15. O gasoduto apresentado aqui descreve uma abordagem abrangente, desde a colheita de amostra para análise de dados e interpretação. Um dos passos mais importantes é a criação de um procedimento de amplificação por PCR para melhorar a eficiência da PCR das regiões GC enriquecido no genoma como este é onde ocorre a metilação…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O trabalho é apoiado pelo CPRIT Research Training Award RP140105, bem como parcialmente suportado pelo US National Institutes of Health (NIH) concede R01 GM114142 e por William & Ella Owens Medical Research Foundation.

Materials

Methylminer DNA enrichment Kit Invitrogen ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen 112-05D
Bioruptor Plus Sonication Device diagenode B01020001
3M sodium acetate pH 5.2 Sigma S7899 100ml
SPRIworks Fragment Library System I Beckman Coulter A50100 Fully automated library construction system
Adapter Primers Bioo Scientific 514104 PCR primer mix
Qubit Invitrogen Q32854 Fluorometric Quantitation System
PCR master mix KAPA scientific KK2621 PCR master mix
AMPure XP Beckman Coulter A63881 PCR Purification beads
EB Buffer Qiagen 19086
HiSeq 2000 Sequencing System Illumina

References

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Cite This Article
Jadhav, R. R., Wang, Y. V., Hsu, Y., Liu, J., Garcia, D., Lai, Z., Huang, T. H. M., Jin, V. X. Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues. J. Vis. Exp. (116), e54131, doi:10.3791/54131 (2016).

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