Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b
Summary
De interactie tussen HCN kanalen en hun ondersteunende subunit is geïdentificeerd als een therapeutisch doel in depressieve stoornis. Hier wordt een fluorescentie-polarisatie- methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van dit eiwit-eiwit interactie, gepresenteerd.
Abstract
-Hyperpolarization cyclisch-nucleotide-gated (HCN) kanalen zijn een rode draad door de hersenen, waar ze functioneren om de prikkelbaarheid van neuronen reguleren uitgedrukt. De subcellulaire verdeling van deze kanalen in piramidale neuronen in de hippocampus CA1 gebied wordt geregeld door tetratricopeptide-repeat bevattende Rab8b interactie eiwit (TRIP8b), een extra subunit. Genetische knockout HCN porievormende subeenheden of TRIP8b, beide leiden tot een toename antidepressivum-achtige gedrag, wat suggereert dat het beperken van de werking van HCN kanalen bruikbaar voor de behandeling van depressieve stoornis (MDD) kan zijn. Ondanks aanzienlijk therapeutisch belang zijn HCN kanalen ook tot uiting in het hart, waar ze reguleren ritmiek. Af-target problemen geassocieerd met cardiale blokkeren HCN kanalen omzeilen, heeft ons lab onlangs voorgesteld gericht op de eiwit-eiwit interacties tussen HCN en TRIP8b teneinde specifiek verstoren HCN kanaal functie in de hersenen.TRIP8b bindt aan HCN porievormende subeenheden op twee verschillende interactie sites, maar hier ligt de nadruk op de interactie tussen de tetratricopeptide repeat (TPR) domeinen van TRIP8b en de C-terminale staart van HCN1. In dit protocol, een geëxpandeerde beschrijving van een werkwijze voor het zuiveren TRIP8b en uitvoeren van een hoge doorvoer screen aan kleinmoleculige remmers van de interactie tussen HCN en TRIP8b identificeren beschreven. Werkwijze voor high throughput screening gebruikt een fluorescentie polarisatie (FP) gebaseerde assay te controleren de binding van een groot fragment TRIP8b een fluorofoor-gelabeld elf aminozuur peptide dat overeenkomt met de HCN1 C terminale staart. Deze methode maakt treffer verbindingen te identificeren gebaseerd op de verandering in de polarisatie van het uitgezonden licht. Validatie testen worden dan uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de 'hit' verbindingen zijn niet kunstmatig.
Introduction
-Hyperpolarization cyclisch-nucleotide-gated (HCN) kanalen worden uitgedrukt in het hart en het centrale zenuwstelsel waar ze een belangrijke rol in het reguleren membraan prikkelbaarheid 1 spelen. HCN kanalen zijn geïmpliceerd bij de pathogenese van depressieve stoornis (MDD) 2, die verschillende groepen heeft geleid tot voorstellen beperken HCN kanaalfunctie farmacologisch effectief als een nieuwe behandeling voor MDD 3 kan zijn. Echter direct gericht HCN kanalen niet levensvatbaar vanwege hun belangrijke rol in de cardiale actiepotentiaal 4. Ivabradine, de enige FDA goedgekeurde HCN kanaal antagonist wordt gebruikt voor de behandeling van hartfalen een Bradycardie 5 produceren. Als zodanig is er een behoefte aan farmacologische middelen die HCN kanaalfunctie uitsluitend in het centrale zenuwstelsel te beperken.
Tetratricopeptide herhaal-bevattende Rab8b interactie eiwit (TRIP8b) is een brein specific extra subunit van HCN kanalen die de oppervlakte-expressie en lokalisatie van HCN kanalen 6,7 regelt. Genetische knock-out van TRIP8b zorgt voor een vermindering van de hersenen HCN kanalen 7 zonder dat HCN expressie in het hart 8. Interessant TRIP8b knockout muizen besteden minder tijd onbeweeglijk over de gedwongen zwemmen taak en staart schorsing taak 7, twee veelgebruikte screening tests voor de antidepressieve werking 9-11. Deze resultaten suggereren dat in plaats van direct targeting HCN kanalen met een klein molecuul antagonist van HCN kanalen functie verstoren van de interactie tussen TRIP8b en HCN kan voldoende zijn om antidepressivum-achtige gedrag produceren.
TRIP8b bindt aan HCN in twee verschillende bindingsplaatsen. De cyclische nucleotide bindend domein (CNBD) HCN samenwerkt met een geconserveerd domein van TRIP8b gelegen N terminal naar de TPR-domeinen van TRIP8b 12,13. Hoewel de resten van de CNBD die betrokken zijn bij dezeinteractie zijn in kaart gebracht 14 is TRIP8b regio die betrokken is niet ingeperkt voorbij een-80-aminozuurfragment 13. Een tweede interactie plaatsvindt tussen de tetratricopeptide repeat (TPR) domeinen van TRIP8b en de C-terminale tripeptide van HCN ( 'SNL' in HCN1, HCN2 en HCN4, maar 'ANM in HCN3) 3,12. Het onlangs opgelost kristalstructuur 15 van deze C staart interactie onthulde aanzienlijke structurele gelijkenis met de interactie tussen de peroxisomale import receptor, peroxin 5 (Pex5), en de interactie partners, met type 1 peroxisomale targeting sequenties (PTS1) 16.
Hoewel beide interactieplaatsen zijn vereist voor HCN kanaalfunctie, de interactie tussen de TPR-domeinen van TRIP8b en de C-terminale tripeptide van HCN1 dient als de dominante bindingsplaats en reguleert HCN oppervlakte-expressie. Daarom werd deze interactie gekozen als targeting site in deze studie.Voor de rest van het manuscript Wanneer verwezen wordt naar de interactie tussen TRIP8b en HCN, is deze interactie die wordt aangeduid. Deze interactie wordt herinnerd aan een sterk oplosbaar fragment van TRIP8b overeenkomstig zijn geconserveerde C eind bevattende de TPR-domeinen nodig zijn voor binding van het C-terminale staart van HCN (residuen 241-602 van de 1a-4 isovormen van TRIP8b) 3.
Om een hoge doorvoer screen kleine moleculen die het ontwrichten van de interactie kaart te brengen, een fluorescentie polarisatie (FP) gebaseerde assay werd toegepast 17. Fluorescentiepolarisatie is gebaseerd op de excitatie van een fluorofoor-gelabeld ligand met gepolariseerd licht, en het meten van de mate van polarisatie van de uitgezonden fluorescentie 18. In aanwezigheid van een bindingspartner, wordt de rotatiebeweging van de fluorescerende ligand beperkt en gepolariseerd licht uitgezonden 19. Bij gebrek aan een bindingspartner, thij rotatiebeweging van de ligand leidt tot de emissie van gedepolariseerde licht.
In de bijgevoegde protocol, wordt een werkwijze voor het zuiveren van N-terminale tag (6xHis) TRIP8b (241-602) middels nikkel-Nitrilotriazijnzuur (Ni-NTA) kralen gepresenteerd. Een soortgelijk protocol werd toegepast om de glutathion-S-transferase (GST) gemerkte C-terminale 40 aminozuren van HCN1 (HCN1 C40) toegepast in stap 7 van het protocol zuiveren. Voor ruimte overwegingen, een gedetailleerde beschrijving van deze procedure werd weggelaten.
In de stappen 2 tot en met 7 van het protocol, is een high throughput screening workflow gepresenteerd (zie figuur 1). Eiwit-eiwit interacties zijn een notoir moeilijk doelwit voor high throughput screening en de lezers worden geadviseerd om te zoeken naar extra middelen op het onderwerp 20.
Stap 2 en 3 van de procedure te karakteriseren de in vitro affiniteit van het gezuiverde TRIP8b (241-602) te construeren fora fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) gemerkte elf aminozuur peptide dat overeenkomt met de C-terminale staart van HCN1 (HCN1 FITC). Gebaseerd op de kristalstructuur van de TRIP8b HCN-complex 15 Deze elf aminozuur segment voldoende is om binding met TRIP8b (241-602). In stap 2 wordt de Kd van de interactie gemeten door titratie TRIP8b (241-602) in een vaste concentratie van HCN1 FITC. In stap 3 wordt een ongemerkt versie van de HCN peptide in stap 2 getitreerd in een vaste concentratie van zowel TRIP8b (241-602) en FITC HCN1 te onderzoeken of de FITC tag interfereert met binding. Deze experimenten zijn essentieel voor het selecteren van de geschikte concentraties van TRIP8b (241-602) en HCN1 FITC gebruikt bij de hoge doorvoer screen.
Het uitgangspunt van de high throughput scherm is dat een klein molecuul in staat is het verstoren van de interactie tussen TRIP8b (241-602) en HCN1 FITC zal een december producerenrease in gepolariseerd licht. In stap 4 wordt de Z-factor van de test berekende 21 voor een bepaalde concentratie van TRIP8b (241-602) en FITC HCN1 dat de bepaling geschikt zijn voor high throughput screening (stap 5) is. Stappen 6 en 7 zijn validatie testen om te bevestigen dat de klappen die in de primaire hoge doorvoer screen handelen door het verstoren van de interactie tussen TRIP8b (241-602) en HCN1 FITC plaats van via een niet-specifieke mechanisme. In stap 6, carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) -gemerkte HCN1 peptide (HCN1 TAMRA) wordt gebruikt in een overigens identieke fluorescentie polarisatie assay fluorescerende verbindingen die de FP test met het FITC tag compromis filteren. Stap 7 gebruikt een groter HCN1 C terminale fragment (HCN1 C40) en maakt gebruik van een bead based proximity assay die is gebaseerd op het 'tunneling' van singlet zuurstof uit een donor kraal een acceptor kraal bracht dicht bij elkaar door interagerende proteïnen 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wegens zijn potentieel als een therapie bij MDD 24, is er veel belangstelling voor farmacologische benaderingen die HCN kanaalfunctie antagoniseren in het centrale zenuwstelsel 4 geweest. Echter, deze inspanningen tot stilstand gekomen door de belangrijke rol van HCN kanalen in cardiale pacemaking en het risico van aritmie 25. We redeneerden dat het verstoren van de interactie tussen HCN en brein geëxpresseerd auxiliaire subeenheid, TRIP8b 8 voldoende antidepressivum-achtige …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.), and National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). A part of this work was performed by the Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) at the Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), which is funded by the Chicago Biomedical Consortium with support from the Searle Funds at the Chicago Community Trust and Cancer Center Support Grant P30 CA060553 from the National Cancer Institute awarded to the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. The high throughput screen work was performed in the High Throughput Analysis Laboratory which is also a core facility of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Dialysis cassette | ThermoFisher | 66456 | |
| Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502-1G | |
| 384 Well Black plate | Corning | 3820 | |
| Proxiplate | Perkin-Elmer | 6008289 | |
| Anti-GST Acceptor beads | Perkin-Elmer | 6760603C | |
| NiChelate | Perkin-Elmer | AS101D | |
| pGS21-a | Genscript | SD0121 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Coomassie Kit | ThermoFisher | 23200 | |
| Protein concentrator | ThermoFisher | 88527 | |
| Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader | Perkin-Elmer | #2300-001M | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | Agilent | 200131 |
References
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).
- Shah, M. M. HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders?. Sci Signal. 5 (244), pe44 (2012).
- Han, Y., et al. Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels. J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).
- Postea, O., Biel, M. Exploring HCN channels as novel drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).
- Stieber, J., Wieland, K., Stöckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors. Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).
- Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction. J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).
- Lewis, A. S., et al. Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice. J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).
- Heuermann, R. J., et al. Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy. Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).
- Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).
- Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity. Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).
- Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice. Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).
- Han, Y., et al. Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites. J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).
- Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP. J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).
- Saponaro, A., et al. Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).
- Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).
- Gatto, G. J., Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5. Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).
- Owicki, J. C. Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer. J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).
- Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
- Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. 生物化学. 43 (51), 16056-16066 (2004).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Eglen, R. M., et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).
- Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. . Lehninger Principles of Biochemistry. , (2000).
- Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors. Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).
- Wahl-Schott, C., Biel, M. HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function. Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).
- DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b. Structure. 23 (4), 734-744 (2015).
- Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).
- Prinz, H. Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms. J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).
- Pollard, T. D. A Guide to Simple and Informative Binding Assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
- Rossi, A. M., Taylor, C. W. Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization. Nat Protoc. 6 (3), (2011).
- Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -. W. Effect of Detergent on “Promiscuous” Inhibitors. J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).
- McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening. J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).
- Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).
