Procédé pour l'identification d'inhibiteurs de petites molécules de l'interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b
Summary
L'interaction entre les canaux HCN et leur sous-unité auxiliaire a été identifié comme une cible thérapeutique dans le trouble dépressif majeur. Ici, une méthode basée sur la polarisation de fluorescence pour identifier les petites molécules inhibitrices de cette interaction protéine-protéine, est présentée.
Abstract
(HCN) canaux de nucleotide cyclique activé par hyperpolarisation sont exprimés de façon ubiquitaire dans le cerveau, où ils fonctionnent pour réguler l'excitabilité des neurones. La distribution subcellulaire de ces canaux dans les neurones pyramidaux de la zone hippocampique CA1 est régulée par tétratricopeptide Rab8b contenant des protéines de répétition interagissant (TRIP8b), une sous-unité auxiliaire. KO génétique de HCN formation de pores sous-unités ou TRIP8b, à la fois conduire à une augmentation des comportements antidépresseur, ce qui suggère que la limitation de la fonction des canaux HCN peut être utile en tant que traitement du trouble dépressif majeur (TDM). Malgré l'intérêt thérapeutique significatif, les canaux HCN sont également exprimés dans le cœur, où ils régulent la rythmicité. Pour contourner les problèmes hors-cible associés aux bloquant les canaux HCN cardiaques, notre laboratoire a récemment proposé le ciblage de l'interaction protéine-protéine entre HCN et TRIP8b afin de perturber spécifiquement la fonction du canal HCN dans le cerveau.TRIP8b se lie à HCN pore formant des sous-unités à deux sites d'interaction distincts, bien qu'ici l'accent est mis sur l'interaction entre la répétition de tétratricopeptide (TPR) domaines de TRIP8b et la C queue terminale de HCN1. Dans ce protocole, une description plus détaillée d'un procédé de purification TRIP8b et l'exécution d'un écran à haut débit pour identifier les petites molécules inhibitrices de l'interaction entre HCN et TRIP8b, est décrit. Le procédé de criblage à haut débit utilise une polarisation de fluorescence (FP) à base de test pour surveiller la liaison d'un grand fragment de TRIP8b à un onze fluorophores marqués aminés peptide acide correspondant à la queue terminale HCN1 C. Cette méthode permet de composés «hit» d'être identifiés sur la base de la variation de la polarisation de la lumière émise. tests de validation sont ensuite effectués pour veiller à ce que «hit» composés ne sont pas artifactual.
Introduction
(HCN) canaux de nucleotide cyclique hyperpolarisation activé sont exprimés dans le cœur et le système nerveux central où ils jouent un rôle important dans la régulation de l' excitabilité membrane 1. Canaux HCN ont été impliqués dans la pathogenèse du trouble dépressif majeur (MDD) 2, ce qui a conduit plusieurs groupes de proposer que la limitation de HCN fonction du canal pharmacologiquement peut être efficace comme un nouveau traitement pour CDEM 3. Cependant, ciblant directement les canaux HCN est pas viable en raison de leur rôle important dans le potentiel d'action cardiaque 4. Ivabradine, le seul approuvé par la FDA antagoniste des canaux HCN, est utilisé pour le traitement de l' insuffisance cardiaque pour produire un effet bradycardie 5. En tant que tel, il existe un besoin pour des agents pharmacologiques qui limitent la fonction des canaux HCN exclusivement dans le système nerveux central.
Tétratricopeptide répéter contenant Rab8b interacting protein (TRIP8b) est une spécificité du cerveaufic sous – unité auxiliaire des canaux HCN qui contrôle l'expression de surface et la localisation des canaux HCN 6,7. KO génétique des TRIP8b provoque une diminution du cerveau canaux HCN 7 sans affecter l' expression de HCN au cœur 8. Fait intéressant, les souris knock – out TRIP8b passent moins de temps immobile sur la tâche de la tâche de la nage forcée et la queue suspension 7, deux tests de dépistage couramment utilisés pour l' efficacité antidépressive 9-11. Ces résultats suggèrent que plutôt que de cibler directement les canaux HCN avec une petite molécule antagoniste fonction du canal HCN, perturbant l'interaction entre TRIP8b et HCN peut être suffisante pour produire un comportement antidépresseur.
TRIP8b se lie à HCN à deux sites de liaison distincts. Le domaine de liaison des nucléotides cycliques (CNBD) de HCN interagit avec un domaine conservé de la borne N TRIP8b situé aux domaines de TPR de TRIP8b 12,13. Bien que les résidus du CNBD qui sont impliqués dans cetteinteraction ont été cartographiés 14, la région de TRIP8b qui est impliqué n'a pas été réduite au – delà de fragment d'acide an-80-amino 13. Une seconde interaction se produit entre les domaines de répétition tétratricopeptide (TPR) de TRIP8b et la C tripeptide terminale de HCN ( «SNL» dans HCN1, HCN2 et HCN4, mais 'ANM' dans HCN3) 3,12. La structure cristalline a récemment résolu 15 de cette C queue interaction a révélé une similarité structurale importante à l'interaction entre le récepteur à l'importation des peroxysomes, Peroxin 5 (PEX5), et ses partenaires d' interaction, contenant de type 1 peroxysomaux ciblant des séquences (PTS1) 16.
Bien que les deux sites d'interaction sont nécessaires pour le fonctionnement des canaux HCN, l'interaction entre les domaines TPR de TRIP8b et la borne C du tripeptide HCN1 sert de site de liaison dominant et régule l'expression de surface de HCN. Par conséquent, cette interaction a été choisi comme site de ciblage dans cette étude.Pour le reste du manuscrit, lorsqu'il est fait référence à l'interaction entre TRIP8b et de HCN, il est que cette interaction est fait référence. Cette interaction est récapitulée par un fragment hautement soluble de TRIP8b correspondant à son terminal conservé C contenant les domaines TPR requis pour la liaison C queue terminale de HCN (résidus 241-602 de 1a-4 isoformes de TRIP8b) 3.
Afin de développer un écran à haut débit pour identifier des petites molécules capables de perturber cette interaction, une polarisation de fluorescence (FP) à base de test a été utilisé 17. La polarisation de fluorescence est basée sur l'excitation d'un ligand marquée par un fluorophore avec une lumière polarisée, et à mesurer le degré de polarisation de la fluorescence émise 18. En présence d'un partenaire de liaison, le mouvement du ligand fluorescent de rotation est limitée et la lumière polarisée est émis 19. En l'absence d'un partenaire de liaison, til mouvement du ligand de rotation conduit à l'émission de lumière dépolarisée.
Dans le protocole ci-joint, un procédé pour la purification de N tagged terminal (6xHis) TRIP8b (241-602) en utilisant de l'acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA) des billes est présenté. Un protocole similaire a été utilisée pour purifier le glutathion-S-transférase (GST) -tagged C terminaux 40 acides aminés de HCN1 (HCN1 c40) utilisé dans l' étape 7 du protocole. Pour des considérations d'espace, une description détaillée de cette procédure a été omise.
Dans les étapes 2 à 7 du protocole, un dépistage flux de travail à haut débit est présenté (voir Figure 1). Les interactions protéine-protéine sont une cible notoirement difficile pour le criblage à haut débit et les lecteurs sont invités à rechercher des ressources supplémentaires sur le sujet 20.
Les étapes 2 et 3 de la procédure de caractériser l'affinité in vitro du TRIP8b purifié (241-602) construire fora isothiocyanate de fluorescéine (FITC) -tagged onze peptide d'acides aminés correspondant à l' extrémité C terminale de la queue HCN1 (HCN1 FITC). Sur la base de la structure cristalline du complexe HCN TRIP8b-15, ce segment d'acides aminés onze est suffisante pour produire la liaison avec TRIP8b (241-602). Dans l' étape 2, la valeur de Kd de l'interaction est mesurée par titrage TRIP8b (241-602) en une concentration fixe de HCN1 FITC. À l' étape 3, une version non marquée du peptide HCN utilisé dans l' étape 2 est titré en une concentration fixe de deux TRIP8b (241-602) et HCN1 FITC pour examiner si la balise FITC interfère avec la liaison. Ces expériences sont essentielles pour le choix des concentrations appropriées de TRIP8b (241-602) et HCN1 FITC utilisés dans le criblage à haut débit.
La prémisse de l'écran à haut débit est qu'une petite molécule capable de perturber l'interaction entre TRIP8b (241-602) et HCN1 FITC produira un décembrerease en lumière polarisée. A l' étape 4, le facteur Z de l'essai est calculée 21 pour une concentration donnée de TRIP8b (241-602) et HCN1 FITC pour garantir que l'essai est approprié pour le criblage à haut débit (étape 5). Les étapes 6 et 7 sont des essais de validation pour confirmer que les résultats identifiés dans l'écran à haut débit primaire agissent en perturbant l'interaction entre TRIP8b (241-602) et HCN1 FITC plutôt que par un mécanisme non spécifique. Dans l' étape 6, carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA) marqué au HCN1 peptide (HCN1 TAMRA) est utilisé dans un essai de polarisation de fluorescence par ailleurs identique à filtrer des composés fluorescents qui compromettent le dosage FP utilisant le tag FITC. Etape 7 utilise un plus grand HCN1 fragment C terminal (HCN1 C40) et emploie une analyse de proximité à base de billes, qui est basé sur le «tunnel» d'un oxygène singulet à partir d' un cordon de donneur à un bourrelet d'accepteur amené à proximité les uns des autres par des protéines qui interagissent 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
En raison de son potentiel en tant que cible thérapeutique dans 24 CDEM, il y a eu un intérêt considérable dans les approches pharmacologiques qui contrarient la fonction du canal HCN dans le système nerveux central 4. Cependant, ces efforts ont été bloquées par le rôle important des canaux HCN dans pacemaker cardiaque et le risque d'arythmie 25. Nous avons pensé que perturber l'interaction entre HCN et sa sous – unité auxiliaire spécifique du cerveau, TRIP8b 8,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.), and National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). A part of this work was performed by the Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) at the Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), which is funded by the Chicago Biomedical Consortium with support from the Searle Funds at the Chicago Community Trust and Cancer Center Support Grant P30 CA060553 from the National Cancer Institute awarded to the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. The high throughput screen work was performed in the High Throughput Analysis Laboratory which is also a core facility of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Dialysis cassette | ThermoFisher | 66456 | |
| Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502-1G | |
| 384 Well Black plate | Corning | 3820 | |
| Proxiplate | Perkin-Elmer | 6008289 | |
| Anti-GST Acceptor beads | Perkin-Elmer | 6760603C | |
| NiChelate | Perkin-Elmer | AS101D | |
| pGS21-a | Genscript | SD0121 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Coomassie Kit | ThermoFisher | 23200 | |
| Protein concentrator | ThermoFisher | 88527 | |
| Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader | Perkin-Elmer | #2300-001M | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | Agilent | 200131 |
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