Summary

تحديد موثوق المعيشة الدوبامين الخلايا العصبية في الدماغ المتوسط ​​الثقافات عن طريق RNA تسلسل وTH يحركها المروج EGFP التعبير

Published: February 10, 2017
doi:

Summary

في مرض باركنسون (PD)، المادة السوداء (SNC) الخلايا العصبية الدوبامين تتحول، مما يؤدي إلى خلل وظيفي السيارات. نحن هنا نورد بروتوكول لزراعة الخلايا العصبية الدماغ المتوسط ​​بطني من ماوس معربا عن EGFP يقودها تسلسل المروج هيدروكسيلاز التيروزين (TH)، حصاد الخلايا العصبية الفلورسنت الفردية من الثقافات، وقياس Transcriptome على الخاصة بهم باستخدام الحمض النووي الريبي يليها.

Abstract

في مرض باركنسون (PD) هناك فقدان الخلايا العصبية على نطاق واسع في جميع أنحاء الدماغ مع انحطاط وضوحا من الخلايا العصبية الدوبامين في المجلس الوطني السوري، مما يؤدي إلى بطء الحركة، وصلابة، والزلزال. تحديد يعيشون الخلايا العصبية الدوبامين في الثقافات الأولية بطني الدماغ المتوسط ​​(VM) باستخدام علامة فلوري يوفر وسيلة بديلة لدراسة الضعف الانتقائي لهذه الخلايا العصبية دون الاعتماد على المناعية للخلايا ثابتة. هنا، نحن عزل، فصل، والثقافة الماوس VM الخلايا العصبية لمدة 3 أسابيع. ثم نحدد الخلايا العصبية الدوبامين في الثقافات باستخدام EGFP مضان (يقودها المروج هيدروكسيلاز التيروزين (TH)). ويتم حصاد الخلايا العصبية الفردية في أنابيب microcentrifuge باستخدام بال micropipettes الزجاج. المقبل، ونحن ليز الخلايا تحصد، وإجراء توليف [كدنا وبوساطة ينقول "tagmentation" لإنتاج خلية واحدة-RNA يليها مكتبات الحمار = "XREF"> 5. بعد اجتياز فحص لمراقبة الجودة، والتسلسل المكتبات وحيدة الخلية ويتم تحليلها لاحقا إلى قياس التعبير الجيني. نفيدكم النتائج Transcriptome على لالدوبامين الفردية والخلايا العصبية GABAergic معزولة عن الثقافات الدماغ المتوسط. نفيدكم أن 100٪ من خلايا TH-EGFP الحية التي تم حصادها والتسلسل كانت الخلايا العصبية الدوبامين. وهذه التقنيات لها تطبيقات واسعة في علم الأعصاب وعلم الأحياء الجزيئي.

Introduction

مرض باركنسون (PD) هو، اضطراب الاعصاب عضال المرتبطة بالعمر. سبب هذا الاضطراب شائع نسبيا لا تزال غير مفهومة. هناك خسارة واسعة النطاق العصبية في جميع أنحاء الدماغ، مع انحطاط الخلايا العصبية وضوحا من الخلايا العصبية الدوبامين في المادة السوداء (SNC)، مما يؤدي إلى مظاهر سريرية التشخيص من بطء الحركة والجمود والهزة.

الثقافات المختلطة الابتدائية التي تحتوي على SNC الخلايا العصبية الدوبامين هي ذات الصلة وخاصة لمرض الشلل الرعاش. قد تورطت بطني السقيفية المنطقة (VTA) الخلايا العصبية الدوبامين في الثواب والإدمان. بطني الدماغ المتوسط ​​(VM) الابتدائية الثقافات الجنينية مختلطة تحتوي على كل SNC وVTA الدوبامين (DA) الخلايا العصبية والخلايا العصبية GABAergic. يمكن VM الثقافات الأولية أن تكون مفيدة لفحوصات العصبية ولإلقاء الضوء على ضعف انتقائي من الخلايا العصبية الدوبامين. لا توجد وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتحديد الخلايا الدوبامين في ثقافة تقوم على التشكل. هوإعادة نطور تقنيات لتحديد وحصاد الخلايا العصبية الدوبامين واحدة، وبناء وحيدة الخلية، وارتفاع العائد المكتبات RNA التسلسل.

نحن إبلاغ بيانات الحمض النووي الريبي Transcriptome على تمثيلية للالدوبامين واحد والخلايا العصبية GABAergic معزولة عن الثقافات الدماغ المتوسط. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لالعصبية، التنكس العصبي، والمقايسات الدوائية لدراسة آثار العلاجات المختلفة على Transcriptome على DA / GABA. لأن الخلايا العصبية الدوبامين تمثل أقلية صغيرة من الخلايا العصبية التي أعرب عنها في الثقافات VM الأولية، فإن القدرة على تحديد موثوق هذه الخلايا العصبية في الثقافات التي تعيش تمكين مجموعة محسنة من الدراسات وحيدة الخلية. وهذه التقنيات الجديدة تسهيل التقدم في فهم الآليات التي تجري على المستوى الخلوي، ويمكن أن تكون لها تطبيقات في أماكن أخرى في مجالات علم الأعصاب وعلم الأحياء الجزيئي.

Protocol

ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للرعاية واستخدام الحيوانات التي تقدمها المعاهد الوطنية للصحة، وبروتوكولات تمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا. 1. اشتقاق ال…

Representative Results

نحن هنا نورد بروتوكول لزراعة الخلايا العصبية الدماغ المتوسط بطني من ماوس معربا عن EGFP يقودها تسلسل المروج هيدروكسيلاز التيروزين، حصاد الخلايا العصبية الفلورسنت الفردية من الثقافات، وقياس Transcriptome على RNA وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي يليها (…

Discussion

نحن هنا عزل الخلايا واحد من السكان غير متجانسة باستخدام علامة فلوري، ثم دراسة كل خلية مع وحيدة الخلية RNA وما يليها. نفيدكم أن 100٪ من خلايا TH-EGFP حية أننا حصادها والتسلسل كانت الخلايا العصبية الدوبامين في الواقع، على أساس وجود ثلاث نسخ الجينات المرتبطة DA التالية، TH، DDC وs…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.

Materials

Papain Worthington Biochemical Corporation  LS003126
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X Gibco  14175-095
Donor Equine Serum Thermo Scientific  SH30074.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A7030-50G
Medium: Neurobasal medium Gibco  21103-049
Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX Gibco  35050-061 0.5 mM final concentration.
L-Ascorbic acid Sigma  A7506
B27 Gibco  17504-044 50 X stock solution, 1 X final concentration.
35 mm glass bottom dishes MatTek   P35GC-1.5-10-C
Poly-L-Ornithine Sigma  P4957
Laminin Sigma  L2020 Stored at -20°C in 20 µL aliquots
Deoxyribonuclease I (DNase) Sigma  DN25
Blue pipette tips Sorenson Bioscience,  Inc. 10130
P1000
10 mm shallow Petri dish VWR  25384-324
37°C Water bath
37°C, 5% humidity incubator
16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
Triton X-100 Sigma  X100-500ML
Donkey serum Equitech  SD-0100HI 100% stock solution, 1% final concentration.
Standard Pattern surgical scissors Fine Science Tools 14000-14
Forceps – 2×3 teeth Fine Science Tools 11022-14
Forceps – Dumont #55 Fine Science Tools 11295-51
Forceps – Dumont #5 Fine Science Tools 11252-23
10X PBS, pH 7.4 Gibco  70011-044
Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X Gibco 14190-144 500 ml 
21 guage needle  BD PrecisionGlide Needle 305167 100 needles
Micropipette puller Sutter Instrument. model P-87
Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-285
Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing Clontech 634936 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit
oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) From the SMARTer Kit 
Reverse transcriptase (100 units) SMARTcribe reverse transcriptase From the SMARTer Kit 
Primer 1 3’ CDSIIa primer  From the SMARTer Kit
Primer 2 IS PCR primer From the SMARTer Kit
50X 2 polymerase mix 50X Advantage 2 polymerase mix From the SMARTer Kit
10X PCR buffer 10X Advantage 2 PCR buffer From the SMARTer Kit
RNA Spikes ThermoFisher 4456740
PCR cooler rack IsoFreeze PCR cooler rack.
DNA Sample Preparation Kit  (Illumina/Nextera) Nexter FC-121-1030 24 Samples
PCR master mix Nextera PCR master mix (NPM) From the Nextera Kit 
PCR primer cocktail (PPC)  Nextera PCR primer cocktail (PPC)  From the Nextera Kit
Fluorometer The Qubit ThermoFisher Q33216
HS DNA BioAnalyzer kit Agilent 5067-4626 110rxns
Electrophoresis system  Agilent 2100 Bioanalyzer. G2938C
Magnetic beads: Agencourt AMPure  Beckman Coulter A63880 5ml
RNAse wipe: RNAse Zap wipes Ambion AM9786 Size 100 Sheets
Qubit ds HS Assay Kit Molecular probes  Q32854 500 assays
Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen  28704
Glass capillary tubing (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.)
Microforge Narishige (or equivalent) 
Sequencer Illumina HiSeq instrument
GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain  MMRRC stock number: 000292-UNC Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center

References

  1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
  2. Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
  3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
  4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
  5. Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
  6. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
  8. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  11. Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
  12. Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
  13. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  14. Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
  15. Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).

Play Video

Cite This Article
Henley, B. M., Cohen, B. N., Kim, C. H., Gold, H. D., Srinivasan, R., McKinney, S., Deshpande, P., Lester, H. A. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. J. Vis. Exp. (120), e54981, doi:10.3791/54981 (2017).

View Video