Summary

RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik

Published: February 10, 2017
doi:

Summary

Parkinson Hastalığı (PH), Substansiya Nigra (SNC) dopaminerjik nöronların, motor disfonksiyon neden dejenere. Burada, bir tirosin hidroksilaz (TH) yükseltici sırası ile tahrik EGFP ifade bir fareden ön orta beyin nöronları kültür kültürlerden bağımsız flüoresan nöronlar hasat ve RNA SEQ kullanarak transcriptome ölçmek için bir protokolü sunulmaktadır.

Abstract

Parkinson Hastalığı (PH) bradikinezi, katılık ve titreme neden, Snc dopaminerjik nöronların belirgin dejenerasyon ile beynin genelinde yaygın nöronal kaybı vardır. floresan işaretleyici kullanarak birincil Ventral Mesensefalik (VM) kültürlerde yaşayan dopaminerjik nöronların belirlenmesi sabit hücrelerin immün dayanmadan bu nöronların seçici açığı incelemek için alternatif bir yol sağlar. Burada, izole, ayrışır ve kültür fare VM nöronlar 3 hafta boyunca. Daha sonra (bir tirosin hidroksilaz (TH) promoteri tarafından tahrik edilen) EGFP floresan kullanılarak kültürler dopaminerjik nöronların tanımlar. Bireysel nöronlar cam mikropipetler kullanarak mikrosantrifüj tüpler içine hasat edilir. Sonra, hasat edilen hücreler lize ve tek bir hücre RNA Seq kitaplıkları da 1, 2 üretmek için cDNA sentezi ve transpozon aracılı "tagmentation" yapmak,eşek = "xref"> 3, 4, 5. Bir kalite kontrol kontrolünü geçtikten sonra tek hücreli kütüphaneleri sekanslanır ve sonraki analiz gen ekspresyonunu ölçmek için gerçekleştirilir. Biz bireysel dopaminerjik ve orta beyin kültürlerinden izole edilen GABAerjik nöronlar için transcriptome sonuçlarını rapor. Bu hasat edilmiştir ve dizilenmiştir canlı TH EGFP hücrelerinin% 100 dopaminerjik nöronların olduğunu rapor etmektedir. Bu teknikler nörobilim ve moleküler biyoloji yaygın uygulamalara sahip olacaktır.

Introduction

Parkinson Hastalığı (PH) çaresiz bir, yaşa bağlı nörodejeneratif bir hastalıktır. Bu nispeten yaygın hastalığın nedeni tam olarak anlaşılamamıştır kalır. bradikinezi, katılık ve titreme tanısal klinik özelliklerine lider Substansiya Nigra (SNC) dopaminerjik nöronların belirgin nöron dejenerasyonu ile beynin genelinde yaygın nöron kaybı, vardır.

SNc dopaminerjik nöron içeren primer karma kültürler Parkinson hastalığı için, özellikle önemlidir. Ventral Tegmental Alanı (VTA) dopaminerjik nöronların ödül ve bağımlılık sorumlu tutulmuştur. Ventral Mesensefalik (VM) primer karma embriyonik kültürleri SNc ve VTA dopaminerjik (DA) nöronlar ve GABAerjik nöronlar ikisini de içerir. VM birincil kültürleri nöroprotektif tahlilleri için yararlı olabilir ve dopaminerjik nöronların seçici güvenlik aydınlatmak için. morfolojisi dayalı kültür dopaminerjik hücrelerin belirlemek için güvenilir bir yolu yoktur. obiz tek hücreli, yüksek verim RNA sıralama kütüphaneleri belirlemek ve tek dopaminerjik nöronların hasat ve inşa teknikleri geliştirmek yeniden.

Biz tek dopaminerjik ve orta beyin kültürlerinden izole edilen GABAerjik nöronlar için temsili RNA transcriptome rapor verilerini. Bu protokol, DA / GABA transcriptome çeşitli tedavilerin etkisini incelemek için nöro-koruma, nörodejenerasyon, ve farmakolojik tahliller için de kullanılabilir. dopaminerjik nöronlar primer VM kültürlerinde ifade nöronların küçük bir azınlığı temsil ettikleri için, güvenilir yaşayan kültürlerde bu nöronlar tanımlamak için yeteneği tek hücreli çalışmalarının gelişmiş bir dizi sağlayacaktır. Bu yeni teknikler hücresel düzeyde gerçekleşen mekanizmaların anlaşılması gelişmeler kolaylaştıracak ve başka bir yerde nörobilim ve moleküler biyoloji alanlarında uygulamalar olabilir.

Protocol

NOT: Bütün deneyler bakım ve Ulusal Sağlık Enstitüleri ve protokolleri tarafından sağlanan hayvanların kullanımı için kurallarına uygun olarak yapılmıştır California Institute of Technology Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Embriyonik Fare Beyin Birincil dopaminerjik Hücre Kültürleri 1. türetilmesi Çözümler ve Kültür Orta Askorbik asit stok çözeltisinin hazırlanması askorbik asit 352 mg tartılır. …

Representative Results

Burada, bir tirosin hidroksilaz promotör sekansı ile tahrik eGFP eksprese eden bir fare ön orta beyin nöronları kültür kültürlerden bağımsız flüoresan nöronlar hasat ve RNA SEQ (Şekil 1) kullanılarak, RNA transcriptome ölçmek için bir protokolü sunulmaktadır. veriler toplandı ve dizilenmiştir TH-EGFP-pozitif hücre% 100 aşağıdaki üç DA-ilişkili gen kopyalarının varlığı, Th, dopa dekarboksilaz (DDC), ve dopamin transportörü DAT göre, d…

Discussion

İşte biz o tek hücre RNA seq ile her hücreyi çalışma, bir floresan etiketi kullanarak heterojen bir nüfus tek hücreleri izole. Biz hasat edilmiş ve dizilenmiştir canlı TH EGFP hücrelerinin% 100 aşağıdaki üç DA-ilişkili gen transkriptleri, Th, DDC ve slc6a3 varlığına dayanarak, gerçekten de dopaminerjik nöronların olduğunu rapor etmektedir. RNA Sek tarafından değerlendirilen TH-eGFP pozitif hücrelerin bu üç gen ifade etti. Bu, her bir TH-eGFP hücresi dopaminerjik nöronlar <sup class="xref…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.

Materials

Papain Worthington Biochemical Corporation  LS003126
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X Gibco  14175-095
Donor Equine Serum Thermo Scientific  SH30074.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A7030-50G
Medium: Neurobasal medium Gibco  21103-049
Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX Gibco  35050-061 0.5 mM final concentration.
L-Ascorbic acid Sigma  A7506
B27 Gibco  17504-044 50 X stock solution, 1 X final concentration.
35 mm glass bottom dishes MatTek   P35GC-1.5-10-C
Poly-L-Ornithine Sigma  P4957
Laminin Sigma  L2020 Stored at -20°C in 20 µL aliquots
Deoxyribonuclease I (DNase) Sigma  DN25
Blue pipette tips Sorenson Bioscience,  Inc. 10130
P1000
10 mm shallow Petri dish VWR  25384-324
37°C Water bath
37°C, 5% humidity incubator
16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
Triton X-100 Sigma  X100-500ML
Donkey serum Equitech  SD-0100HI 100% stock solution, 1% final concentration.
Standard Pattern surgical scissors Fine Science Tools 14000-14
Forceps – 2×3 teeth Fine Science Tools 11022-14
Forceps – Dumont #55 Fine Science Tools 11295-51
Forceps – Dumont #5 Fine Science Tools 11252-23
10X PBS, pH 7.4 Gibco  70011-044
Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X Gibco 14190-144 500 ml 
21 guage needle  BD PrecisionGlide Needle 305167 100 needles
Micropipette puller Sutter Instrument. model P-87
Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-285
Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing Clontech 634936 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit
oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) From the SMARTer Kit 
Reverse transcriptase (100 units) SMARTcribe reverse transcriptase From the SMARTer Kit 
Primer 1 3’ CDSIIa primer  From the SMARTer Kit
Primer 2 IS PCR primer From the SMARTer Kit
50X 2 polymerase mix 50X Advantage 2 polymerase mix From the SMARTer Kit
10X PCR buffer 10X Advantage 2 PCR buffer From the SMARTer Kit
RNA Spikes ThermoFisher 4456740
PCR cooler rack IsoFreeze PCR cooler rack.
DNA Sample Preparation Kit  (Illumina/Nextera) Nexter FC-121-1030 24 Samples
PCR master mix Nextera PCR master mix (NPM) From the Nextera Kit 
PCR primer cocktail (PPC)  Nextera PCR primer cocktail (PPC)  From the Nextera Kit
Fluorometer The Qubit ThermoFisher Q33216
HS DNA BioAnalyzer kit Agilent 5067-4626 110rxns
Electrophoresis system  Agilent 2100 Bioanalyzer. G2938C
Magnetic beads: Agencourt AMPure  Beckman Coulter A63880 5ml
RNAse wipe: RNAse Zap wipes Ambion AM9786 Size 100 Sheets
Qubit ds HS Assay Kit Molecular probes  Q32854 500 assays
Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen  28704
Glass capillary tubing (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.)
Microforge Narishige (or equivalent) 
Sequencer Illumina HiSeq instrument
GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain  MMRRC stock number: 000292-UNC Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center

References

  1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
  2. Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
  3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
  4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
  5. Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
  6. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
  8. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  11. Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
  12. Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
  13. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  14. Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
  15. Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).

Play Video

Cite This Article
Henley, B. M., Cohen, B. N., Kim, C. H., Gold, H. D., Srinivasan, R., McKinney, S., Deshpande, P., Lester, H. A. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. J. Vis. Exp. (120), e54981, doi:10.3791/54981 (2017).

View Video